2022, Vol. 21
先天性肛门直肠畸形(anorectal malformations, ARM)是最常见的消化系统出生缺陷，发病率为1/5 000~1/2 000[1]。ARM产前诊断困难，手术是唯一有效的治疗手段。由于ARM病理类型复杂，并伴有肛门括约肌和盆底神经发育不良，术后疗效常不确定，易遗留不同程度肛门直肠和括约肌功能障碍。从致病机制入手，探究ARM发病原因，以早期诊断、早期预防、全方位治疗, 是ARM研究的重要内容。但受限于发病率低、畸形胎儿获得困难、难以模拟胚胎发育异常过程等因素，目前ARM的基础研究进展缓慢，主要集中在胚胎学研究、遗传学研究及近期新起的表观遗传学研究。现针对ARM基础研究领域的进展与展望进行阐述。
一、ARM的研究进展 (一) 胚胎学研究在胚胎发生领域，后肠多指由外胚层起源、来自肛窝的消化管部位，其在时间、空间上的发育过程至今仍无定论，泄殖腔分隔理论和直肠迁移理论分别解释了后肠如何分化为尿道(腹侧)和肛门(背侧)。20世纪初，大家普遍认为后肠发育取决于尿道直肠隔对泄殖腔的分隔作用，但尿道直肠隔在正常胚胎发育过程中是否与泄殖腔膜发生融合仍存在争议[2-3]。Tourneux等[2]认为尿道直肠隔从头侧到尾侧向下移动；而Retterer等[3]推测泄殖腔内出现侧褶，这些侧褶通过融合形成尿道直肠隔。van der Putte[4]在猪模型中否认了尿道直肠隔在泄殖腔分隔过程中的主要作用，推测背侧泄殖腔向下转移至尾部区域建立肛门开口。Kluth等[5]使用扫描电子显微镜详细记录三维立体胚胎结构，并未发现侧褶融合使泄殖腔分隔，且未观察到肛门开口的迁移或背侧泄殖腔的移动，从而推翻了Retterer[3]和van der Putte[4]的理论。波士顿儿童医院针对胎鼠泄殖腔发育的不同阶段构建了三维形态学图像，发现泄殖腔形态的发生和泌尿生殖道与直肠肛门的分隔是尿道直肠隔背侧周围间充质组织在时空维度上重新排列的结果[6]。众多且相对有争议的胚胎学理论导致研究者在面对ARM胚胎学背景时仍然感到困惑。部分学者通过观察新生儿ARM形态，认为直肠在正常发育过程中从高位迁移到肛门的正常区域，如果迁移过程被迫停止，则会形成异位肛门，但至今尚无研究者能拿出支持这种理论的胚胎学证据[7-8]。胚胎学研究进展也常因缺乏合适的动物模型而受阻。目前应用的动物模型包括Danforth短尾小鼠模型、家猪模型、阿霉素、维甲酸、乙烯硫脲致畸大鼠模型等[4, 9-16]。各类基因突变小鼠模型也逐渐应用于ARM发病机制的研究中，主要信号通路相关基因突变有以下几种。
1. Hox基因：HoxD12和HoxD13主要调节间充质组织，特别是平滑肌的发育，HoxD13 (-/-)小鼠表现为平滑肌肌层与黏膜异常分离并在某些区域中断，进而出现直肠扩张。HoxD12 (-/-)小鼠括约肌区域直肠肌层明显紊乱，也有肌层中断现象，与HoxD13 (-/-)小鼠表现类似但较为轻微[17]。HoxA13 (-/-)突变小鼠表现出苗勒管发育不全、膀胱发育停滞和脐动脉狭窄。HoxA13 (+/-)/HoxD13 (-/-)复合突变小鼠阴道、尿道和肛门开口位置不正确，直肠肌层和上皮层发育异常；HoxA13 (-/-)/HoxD13 (+/-)复合突变小鼠的泌尿生殖窦发育严重受损；HoxA13 (-/-)/HoxD13 (-/-)双基因敲除小鼠未见泄殖腔分离成泌尿生殖窦和直肠[18]。
2. Shh (sonic hedgehog)基因：Shh (-/-)小鼠表现为永存泄殖腔。Gli2和Gli3是Shh信号通路中的转录因子，Gli2 (-/-)和Gli3 (-/-)小鼠分别表现为直肠尿道瘘和肛门狭窄；在Gli2 (-/-)/Gli3 (+/-)、Gli2 (+/-)/Gli3 (-/-)和Gli2 (-/-)/Gli3 (-/-)复合突变小鼠中也观察到永存泄殖腔，表明存在基因剂量依赖性效应[19]。
3. Fgf (fibroblast growth factor)基因：Fgf10于胚胎建立肛门直肠连续性时在直肠中表达。Fgf10 (-/-)小鼠在肛门直肠发育关键期直肠和肛门融合失败，出现了肛门直肠畸形表型[20]。
4. Wnt (wingless-type integration site)基因：Wnt5a在胚胎结直肠中表达。Wnt5a (-/-)小鼠表现出包括肛门直肠畸形在内的多种畸形，在胚胎第15.5天可以观察到尿道和肠道之间的瘘管，至胚胎第18.5天，大多数突变小鼠远端肠管显示有盲端[21]。Dkk1是Wnt/β-catenin信号通路的有效抑制剂，肛门生殖系统发育依赖Dkk1介导的Wnt/β-catenin通路动态抑制，Dkk1 (-/-)小鼠表现出尿道生殖器过早形成，最终形成肛门直肠畸形伴尿道瘘表型[22]。
以上胚胎学研究均依据相关信号传导通路基因在肛门直肠发育中的核心作用来构建动物模型，未直接从人类遗传学研究中获取信息，不能真实地模拟人类ARM的胚胎学发病机制。
(二) 遗传学研究目前ARM遗传学病因仍不完全清楚，遗传学研究主要分为以下三类。
1. 根据信号通路相关基因筛选遗传学变异：SHH、WNT和FGF等信号通路在胚胎发育过程中必不可少，动物研究证明这些基因及其信号通路参与后肠发育[19-21]。因此，这些通路中的基因及其下游分子是ARM遗传研究的重要部分。2008年中国香港地区在88例ARM患儿中筛选SHH、GLI3基因突变和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，发现10个GLI3罕见突变(IVS3+141C>G、T183A、IVS4+124T>C、IVS7+17G>A、IVS8+1G>C、N503N、P941P、P998L、A1005A、A1039A)和4个SHH罕见突变(IVS1-49C>T、IVS2+111A>C、L214L、G290D)，表明罕见突变对ARM可能存在致病作用[23]。Carter等[24]选取150例ARM患儿和623例无严重畸形的婴儿，针对25个候选基因中位于转录因子结合位点、CpG岛、剪接位点和miRNA靶向位点的71个常见突变进行筛查，结果显示影响WNT3A、PCSK5、TCF4、MKKS、GLI2、HOXD12和BMP4中转录因子结合、剪接和DNA甲基化的突变与ARM发生相关。还有一些研究调查了FGF和WNT信号通路是否参与ARM的发生，波恩大学研究团队分析了10例VACTERL综合征[vertebral defects (V), anorectal malformations (A), cardiac defects (C), tracheoesophageal fistula with esophageal atresia (TE), renal malformations (R) and limb defects(L)]和10例泄殖腔外翻患儿的FGF10编码区和外显子- 内含子交界区的基因突变，最终结果不支持FGF10作为本研究内ARM或泄殖腔外翻的遗传原因[25]。该大学另一研究团队对78例ARM患儿中的WNT3A、WNT5A、WNT11、DACT1、FGF10、FGFR2和T基因进行了测序分析，将有意义的突变进一步在家庭成员中进行验证，最终未发现这些突变与该ARM研究队列有因果关系[26]。
2. 根据动物研究相关基因筛选遗传学变异：候选基因也可根据动物实验，或与结直肠相关的先天性畸形等方面研究成果来选择。国内有课题组纳入108例ARM患儿和120例对照，在筛选CDX1基因后得到了4个杂合突变(c.213-214InsGAA，c.6G>C，c.27G>T，c.18A>C)，与对照组直肠组织相比，ARM中CDX1的mRNA及蛋白表达均显著降低，提示CDX1下调可能与ARM的发生发展相关[27]。该突变筛选结果并不能直接反映疾病发展过程中蛋白质的变化，确定易感基因的本质仍需进行功能性研究，相比其他ARM遗传学研究，该研究在人群样本中验证了基因表达，但仍然没有直接针对筛选出的突变进行功能探索。中国台湾地区比较了RET基因中特异的SNP位点与ARM、小儿假性肠梗阻及先天性巨结肠的相关性，结果显示ARM患者与正常人群SNP等位基因频率没有差异，先天性巨结肠患者中5个SNP频率与正常人群不同，加强了RET基因中特定SNP与中国台湾地区先天性巨结肠发生的关联[28]。Schramm等[29]报告了一个ARM家系，先证者为ARM合并先天性巨结肠，先证者母亲及姐姐为轻度ARM，在对4个先天性巨结肠相关基因(RET、EDNRB、EDN3和GDNF)和HLXB9进行序列分析后，未发现有意义的遗传改变[29]。Moore等[30]通过14例ARM患儿末端结肠组织标本，筛选EDNRB基因突变，发现3个SNP(178G/A、702C/T、831G/A) 分别与相应的ARM表型相关。
依据信号通路或动物研究策略筛选ARM变异的最大问题在于提前假设致病因素位于候选基因，不能排除上游启动子区、非编码区域的突变是否促成畸形，更不能确定其他基因是否参与了疾病的发生发展。
3. 从基因组或外显子组层面筛选遗传学变异：2013年以后的遗传学研究大多在全基因组或全外显子组层面探索ARM致病因素，例如全基因组关联性研究(genome-wide association study, GWAS)、全基因组拷贝数变异(copy number variant, CNV)研究或全外显子测序研究。在一项规模较小的GWAS及全基因组CNV研究中，未发现任何与ARM相关的常见SNP，但鉴定出114种ARM患儿特有的罕见CNV，确定了1例具有8p11.21区域重复(包含DKK4基因)的患儿，并在小鼠模型中证实Dkk4过表达通过影响WNT信号通路导致ARM[31]。与罕见突变相比，常见SNP影响相对较小，且很难映射到相关基因，对于ARM这类罕见的异质性疾病，若缺乏大样本多中心合作，GWAS研究是否合理有效有待考量。波恩大学遗传学团队对12例罹患ARM且合并两种及以上VACTERL相关临床特征的患者进行了分子核型分析，在其中1例患者中发现了染色体22q11.21区域的微小重复，22q11.2区域易形成重复区段，相关综合征包括velo-cardio-facial综合征、DiGeorge综合征和22q11.2重复综合征，该研究扩展了22q11.2重复综合征的表型谱[32]。该团队随后又在2例ARM患者中使用SNP芯片分析鉴定出染色体13q的缺失，阐述了染色体13q缺失与ARM的关联，提示常规分子诊断应注意寻找这些染色体重复或缺失[33]。为了解释同卵双胞胎为何生后表型不一，他们又使用分子核型分析研究了4对同卵双胞胎(双胎之一表型正常，双胎之二出现ARM或膀胱外翻伴尿道上裂)，结果未发现仅存在于双胎之二且可能致病的CNV，表型不一致的原因可能是调控元件的变化或编码区内较小的遗传改变，需通过全外显子组测序进一步检测[34]。Hilger等[35]对41例具有VATER/VACTERL特征(包含至少3种畸形)和6例具有VATER/VACTERL表型的患者及其父母进行了分子核型芯片分析，发现涉及染色体区域1q41、2q37.3和8q24.3的CNV，分别包含SPATA17和CAPN10、GPR35及EPPK1、PLEC、PARP10基因，胎鼠表达研究表明Gpr35参与了VATER/VACTERL表型的发生发展，对GPR35和包含已确定CNV的其他基因，需要在ARM人群样本中加以验证。以上研究表明，进一步探索染色体结构异常有助于推进ARM遗传学研究。笔者团队曾对一ARM家系进行全外显子测序，初步确定MYH14基因第38外显子中的纯合错义突变(c.5393C>A[p.Ala1806Asp])可能为致病因素，后续将根据此位点设计基因敲除小鼠模型进行验证[36]。
(三) 表观遗传学研究近10年来，国内学者在ARM的表观遗传学研究中开展了重要工作。2014年，Huang等[37]通过检测ARM儿童末端直肠组织中SHH基因的启动子甲基化和表达，发现SHH基因启动子区域高度甲基化、mRNA表达降低，可能是ARM的发病机制。随后诸多学者开始关注非编码RNA在ARM中的表观调控，有学者分别整合了miRNA与mRNA、lncRNA与mRNA在ARM胎鼠后肠组织中的表达谱，构建了包括25个miRNA和76个mRNA的靶基因调控网络，建立了lncRNA和转录因子核心网络，确认了分别由Jun、c-Myc、Usf1、Alf2和Stat3控制的五类lncRNA通路，为进一步研究ARM发病机制提供了依据[38-39]。中国医科大学附属盛京医院团队通过miRNA微阵列分析发现在大鼠肛门直肠形成关键时期，miR-125b-2-3p、miR-92a-2-5p和miR-99a-5p的差异表达可能导致ARM发生，随后通过RNA-seq分析circRNA表达并构建circRNA-miRNA-mRNA网络，在接下来的研究中分别验证了miR-92a-2-5p/Prkca/β-catenin、rno_circ_0004002/miR-342-5p/Wnt3a、rno_circ_0005139/miR-324-3p/Wnt5a三条通路在ARM发生中的作用，为未来ARM的治疗提供了潜在靶点[40-44]。此外，为解释横纹肌复合体发育不良在ARM中的潜在分子机制，中国医科大学附属盛京医院团队还测定了ARM胎鼠横纹肌复合体mRNA和lncRNA表达谱，为开发改善术后肛门排便功能的干预措施提供了理论基础[45]。Yao等[46]发现miR-193可能在调节肛门直肠发育的关键基因HoxD13中发挥重要作用；Mattiske等[47]则发现了lncRNA Leat1的缺失会导致雌性小鼠胚胎发育期泌尿生殖组织中EfnB2的表达减少，并导致雌性小鼠肛门与生殖器距离缩短。
二、目前ARM的研究难点 (一) 胚胎学研究现今仍然缺乏足够多的ARM胚胎模型用于系统的胚胎学研究。多数团队采取连续切片的方式进行胚胎学研究，缺乏三维重建合理解释动态演变过程。在后肠发育理论中，虽然大家普遍接受尿道直肠隔的分隔作用，但对尿道直肠隔的性质及其发展方式没有达成一致。
(二) 遗传学研究不同特征的ARM或不同ARM相关综合征可能具有不同的遗传特征，目前大多数遗传学研究未解决ARM的异质性问题。由于ARM相对罕见，多数研究受到样本量的限制，全外显子测序价格昂贵也成为限制罕见疾病研究开展的因素之一。动物模型有助于揭示ARM的发病机制，为疾病的发育和生理学研究提供新的见解，但很少有ARM研究者在动物模型中验证筛选到遗传改变。
(三) 表观遗传学表观遗传学还包含DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等，目前ARM的研究思路并未拓宽，大多集中于非编码RNA调控，其余方面的作用机制研究尚不丰富，且基本都未纳入人群验证。多篇研究初步确定了miRNA的表达谱，但对miRNA的功能研究多是通过生物信息学工具预测分析其作用靶基因，进而在细胞中进行报告基因实验以证明靶向关系，缺乏miRNA调控网络以及反馈机制的研究。
三、展望以上研究难点导致了目前ARM基础研究推进缓慢，但也为未来基础研究提供了方向。已有学者利用光学投影断层扫描(optical projection tomography, OPT)、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)和光片荧光显微镜(light sheet fluorescence microscopy, LSFM)等三维重建技术对晚期胚胎后肠结构发育进行深刻解读，大范围开展三维相关技术并与遗传学研究相结合是未来胚胎学研究的前景[48]。构建具有ARM表型的基因突变小鼠模型是进一步进行机制研究的重要手段，这些动物模型的研究结果有助于指导、评估和验证从ARM患者身上发现各种变异在疾病中的作用。动物研究与临床研究结果的配对还可以提供开发治疗方法的手段，改善ARM患者的预后。此外，研究重心还应集中在多中心、多家系ARM队列的数据收集，跨地区、跨国家合作有助于阐明ARM潜在的异质病因，进一步根据特定的疾病表型、患者预后和变异结果进行分层分析，也将揭示ARM的遗传结构。研究ARM中基因- 基因和基因- 环境相互作用能增加对ARM发病机制的了解，有助于更好地指导患者及其家属更准确地预估疾病发生的风险，识别高危人群并制定预防策略。
作为基因调控的开关，拓宽ARM表观遗传学研究领域、构建完善成熟的ARM表观遗传网络，对ARM的诊断、预后及新型治疗等具有重要意义。深入研究miRNA的关键在于构建miRNA调控的网络关系以及反馈机制。通过miRNA靶标网络，可以识别出ARM中涉及的关键miRNA，进一步利用miRNA模拟物或拮抗剂调节miRNA在体内的表达和活性，可以达到治疗目的；确定最佳miRNA候选物或miRNA靶标、设计miRNA递送载体、为治疗候选药物提供更高的稳定性、实现组织特异性靶向，以及避免潜在的毒性和脱靶效应，是这种治疗方式必须解决的问题[49-50]；不过ARM的非编码RNA研究还处于初级阶段，可以预见从初步探索到最终治疗的实施，路途依然坎坷。
综上所述，作为最常见的消化系统先天畸形，ARM的基础研究现状远不如其他先天畸形，研究领域也相对局限，这既是机遇，也是挑战。未来的研究趋势应是进一步完善胚胎学、遗传学、表观遗传学、蛋白质组学、代谢组学研究，并将其整合到ARM发生过程中，以提高对ARM发病机制的理解；或为阐明ARM所致的肌肉神经病理改变奠定基础，进而改善术后排便功能，提高治疗效果及远期生存质量，推动精准医疗在ARM预防和治疗中的发展。
利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突
作者贡献声明 朱中贤、唐维兵负责文章的撰写；唐维兵负责文章的修改，并对文章知识性内容进行审阅
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