2026, Vol. 25
先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HSCR)是由远端肠道缺乏肠神经嵴细胞(Enteric neural crest cells, ENCCs)所致[1]。研究发现，长链非编码RNA母系表达基因3(Maternally expressed gene3，MEG3)可调控细胞增殖、迁移与凋亡，可能参与HSCR的发生[2]，而ENCCs的迁移依赖于上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)[3]，TGF-β/Rac1/JNK通路与EMT过程密切相关[4]，但MEG3是否调控该通路而参与HSCR的发生，目前尚不明确。
资料与方法 一、主要材料与试剂HSCR患儿术后狭窄段与正常吻合段结肠组织各40例(于遵义医科大学附属医院确诊并行根治术)；C57小鼠(本校动物中心)；SH-SY5Y细胞。MEG3慢病毒，FBS，Anti-E-cadherin、Anti-N-cadherin、Anti-JNK、Anti-Vimentin，Anti-Rac1。本研究经我院伦理会批准。
二、实验方法MEG3模型构建：慢病毒感染SH-SY5Y细胞，分组为：①空白对照组(仅SH-SY5Y); ②MEG3低表达组; ③MEG3高表达组; ④阴性对照组。各组培养于含15%FBS+1%P/S DMEM中。
原代ENCCs提取：无菌操作取出胎鼠结肠，序贯法消化后，接种于ENCC完培中；纯化培养至神经球形成，通过免疫荧光法鉴定。
Westernblot：RIPA法提取蛋白并定量后，经电泳、转膜、封闭、抗体孵育，ECL发光法显现条带，ImageJ对其灰度值进行定量分析。
qRT-PCR：总RNA按试剂盒说明提取，去除DNA并浓度标准化(100 ng/μL)后，进行逆转录(37℃ 15 min, 85℃ 5 s)及后续PCR扩增(95℃ 2 min；40个循环：95℃ 10 s, 60℃ 30 s)。
细胞划痕实验：各组细胞以1×106/mL的密度接种并培养24 h后，用无菌枪头划制单一直线划痕；PBS清洗后更换为无血清培养基，分别于0、6、12、24、48 h观察并拍照。
CCK-8增殖实验：将细胞悬液(1×105/mL)按100 μL/孔接种于96孔板；分别于培养24、48、72、96 h后，更换为含10%CCK-8的培养基，孵育2 h后用酶标仪检测450 nm处吸光度。
Transwell迁移实验：将细胞悬液(2×106/mL)按200 μL/孔接种于Transwell小室上室，下室加入700 μL完培，孵育24 h后，对迁移至膜下表面的细胞进行结晶紫染色并计数。
双荧光素酶实验：构建MEG3过表达及pmirGLO-TGF-β-3′UTR野生型(wt)、突变型
(mut) 载体，将载体感染至293T细胞，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性并分析。
三、统计学处理SPSS 29.0进行统计学分析，来自同一患者的不同肠道部位的配对设计数据，采用配对样本t检验；其他独立样本组间比较，采用独立样本t检验；多组间比较行单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05时为差异具有统计学意义。
结果HSCR患儿病变狭窄段结肠组织中的TGF-β表达水平明显低于正常吻合段(图 1)。
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图 1 狭窄段和正常吻合段中TGF-β蛋白(A图)及基因(B图)表达情况 Fig.1 Expression of TGF-β protein(Panel A) and gene (Panel B) in the stenotic and the normal anastomotic segment 注 ***:P＜0.001 |
原代ENCCs培养过程中相互聚集成细胞团，随培养时间延长细胞团逐渐增大并延伸轴突，神经球体积逐渐增大，中间区域暗化、折光性减弱(图 2，红色箭头)；至第9天，神经球细胞融合成团，折光性增强，并开始向周围发出轴突(图 2，绿色箭头)。周围散在的ENCCs持续向中心迁移汇集成团，且增殖加快，表明ENCCs具有较强迁移能力(图 3)。进一步培养后，成熟神经球延伸出透明轴突，并与周围神经球相互连接，形成网络；轴突上出现小结并再发新突，交织成类似肠神经系统的神经网络结构(图 4)，提示该结构由ENCCs经聚集、轴突生长及网络化形成。更换分化培养基24 h后，神经球可进一步分化为多种细胞类型，证明ENCCs具备多向分化潜能(图 5)。
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图 2 原代ENCCs培养生长状况(标尺: 100 μm) Fig.2 Morphological changes of primary ENCCs (scale bar: 100 μm) 注 A:0天；B:1天；C: 3天；D:5天; E:7天；F：9天 |
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图 3 A-C图为不同视野下的ENCCs迁移形成的细胞团(标尺: 100 μm) Fig.3 Panels A-C show the cell clusters formed by the migration of under different fields of view.(scale bar: 100 μm) |
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图 4 成熟神经球形成(A图)，并发出神经轴突(B图)，形成神经网络(C图)(标尺: 100 μm) Fig.4 Formation of mature neurospheres (Panel A), extension of neurites axons (Panel B), and formation of neural networks (Panel C) (scale bar: 100 μm). |
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图 5 A-C图为诱导ENCCs分化后，神经球分化为不同类型的细胞(标尺: 100 μm) Fig.5 Panels A-C show that after induced differentiation of ENCCs, neurospheres differentiate into different types of cells (scale bar: 100 μm) |
ENCCs免疫荧光鉴定：未分化神经球高表达神经嵴干细胞标志物GFAP及神经元标志物NSE，证明ENCCs成功提取与纯化(图 6)；同时表达E-cadherin与N-cadherin，提示其兼具上皮与间质细胞特性(图 7)；诱导分化后，ENCCs稳定表达Nestin与NSE，表明神经标志物在分化后得以维持(图 8)。
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图 6 未分化神经球的NSE及GFAP标志物染色(标尺: 100 μm) Fig.6 Undifferentiated neurospheres immunostained for NSE and GFAP.(scale bar: 100 μm) |
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图 7 EMT标志物E-cadherin、N-cadherin免疫荧光染色(标尺: 100 μm) Fig.7 Immunofluorescence of E-cadherin and N-cadherin, key markers of EMT(scale bar: 100 μm) |
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图 8 诱导分化后ENCCs Nestin、NSE标志物染色鉴定(标尺: 100μm) Fig.8 Staining for Nestin and NSE in ENCCs post-differentiation(scale bar: 100μm) |
在TGF-β野生型细胞中过表达MEG3能显著降低293T细胞的双荧光素酶活性(6.11±0.19比4.32±0.13)；在TGF-β突变型细胞中，过表达MEG3并未显著降低293T细胞的双荧光素酶活性(6.18±0.32比5.80±0.11)；MEG3与TGF-β的预测结合位点见图 9绿色框示意。
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图 9 双荧光素酶活性(A图)及结合位点(B图) Fig.9 Dual-luciferase activity(Panel A) and binding sites(Panel B) 注 ****:P＜ 0.0001; ns: 差异无统计学意义 |
MEG3高表达组TGF-β、Rac1、JNK基因表达量均显著高于空白对照组和低表达组(图 10A)；TGF-β、JNK蛋白表达量显著高于空白对照组和阴性对照组(图 10B)。表明上调MEG3能激活该通路，由此推测当MEG3下调该通路可能被抑制。
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图 10 各组中TGF-β、Rac1、JNK基因(A图)及蛋白(B图)表达情况 Fig.10 Expression of TGF-β, Rac1, and JNK genes(Panel A) and proteins(Panel B) in each group 注 *:P＜0.05; **:P＜0.01; ***:P＜0.001 |
MEG3高表达组E-cadherin蛋白表达显著低于空白对照组；而N-cadherin及Vimentin蛋白表达显著高于空白对照组和低表达组(图 11)。表明上调MEG3能促进细胞的EMT过程。
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图 11 各组中EMT相关蛋白表达情况 Fig.11 Altered expression of EMT-related proteins in different groups |
在培养24 h、48 h后，MEG3高表达组细胞迁移面积(图 12A)、迁移数量(图 12B)显著多于低表达组和空白对照组。结果表明，上调MEG3能明显促进细胞的迁移。
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图 12 A: 划痕实验; B: Transwell实验(标尺: 100 μm) Fig.12 A: Scratch assay; B: Transwell migration assay(scale bar: 100 μm) |
CCK-8增殖试验显示：MEG3高表达组细胞吸光度值显著高于空白对照组及低表达组，而低表达组显著低于空白对照组，且随培养时间延长，各组细胞增殖能力均逐渐增加。表明上调MEG3能促进细胞增殖，反之则会阻碍细胞增殖(图 13)。
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图 13 CCK-8细胞增殖试验 Fig.13 CCK-8 cell proliferation assay |
HSCR是胚胎期肠神经发育异常导致的小儿常见畸形，手术为主要疗法但并发症多，目前肠道干细胞抑制的研究尚处早期[5]。因此，探究影响ECCCs迁移的关键调控因子具有重要意义。研究发现，HSCR患儿中存在特异性表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，但多数lncRNA及其致病途径尚不明确[6]。本团队前期发现MEG3在HSCR病变肠段中表达下调，并可影响SH-SY5Y细胞的迁移和增殖，但其具体调控机制有待深入研究[7]。
EMT是上皮细胞获得间质表型、增强迁移能力的动态可逆过程，细胞可在EMT与间质上皮转化(Mesenchymalepithelial transition, MET)间相互转换，二者均以E-cadherin、N-cadherin和Vimentin为标志[8]。本研究提取的ENCCs兼具上皮与间质标志，提示ENCCs迁移时呈上皮细胞状态，非迁移时呈间质细胞状态，表明ENCCs在早期肠道的迁移过程中存在EMT过程。SH-SY5Y细胞形态及生理生化功能与神经嵴细胞相似，是目前研究HSCR发病机制及相关生物学功能最常用的细胞模型[9]，本研究利用SH-SY5Y细胞模型发现，MEG3高表达可增强细胞迁移与增殖，并上调N-cadherin/Vimentin、下调E-cadherin，表明MEG3可诱导EMT而促进细胞迁移，但其具体调控机制及通路有待进一步研究。
已有研究发现，TGF-β可通过激活Rac1及MAPK信号途径促进细胞侵袭和扩散，维持干细胞特性[10]。并且，MEG3的结合位点富含GA序列，可通过RNA-DNA三链体将MEG3 RNA引导至TGF-β通路靶基因的染色质上，证明TGF-β家族通路基因可作为MEG3的直接靶标[11-12]。这些研究提示，MEG3可能通过与TGF-β/Rac1/JNK信号通路的相互作用，调控细胞侵袭及EMT过程，但MEG3能否通过调控该通路影响ENCC的EMT及迁移，进而导致HSCR发生，目前尚未明确。本研究结果显示，HSCR患者狭窄段中TGF-β表达量显著低于正常吻合段；MEG3可靶向结合TGF-β；在细胞模型中，MEG3高表达组TGF-β、Rac1、JNK的表达均高于空白对照组和低表达组，表明高表达的MEG3可通过靶向该通路，而影响ENCC的EMT过程。
综上，从ENCCs迁移、EMT的角度，探索了MEG3与TGF-β的相互关系在HSCR发病中的作用，以及MEG3对TGF-β的靶向调控作用。但由于lncRNA的作用方式多样，后续还需从RNA与蛋白相互作用、ceRNA调控网络等方面，深入阐述MEG3调控TGF-β的具体分子机制。
利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突
作者贡献声明 文献检索为向路苹、许诗雨；实验过程为向路苹、翟威、许诗雨；数据分析为向路苹、汤成艳；论文结果撰写为向路苹；论文讨论分析为向路苹、刘远梅、金祝
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