2026, Vol. 25
软组织肉瘤(soft tissue sarcoma, STS)起源于间充质组织的恶性肿瘤类型，其病理学亚型极为复杂，根据世界卫生组织相关记录，其涵盖超过100种不同亚型[1]。STS在成人较为少见，约占全部成人恶性肿瘤的1%，但在儿童恶性肿瘤中占比达15%[2]。STS患儿的5年生存率可达50%，但晚期患儿这一比例显著降低[3-5]。近年来针对STS开展的研究大多聚焦于分子分型、靶向治疗以及免疫治疗等领域。Drilon等[6]发现，拉罗替尼、恩曲替尼这类针对NTRK基因融合的TRK抑制剂，在多种携带该突变的肉瘤亚型中呈现出明显且持续的疗效表现。免疫检查点抑制剂(如PD-1/PD-L1抑制剂)在未分化多形性肉瘤及脂肪肉瘤中也展示出一定的治疗潜能[7]。在上皮样肉瘤等亚型中，INI1(SMARCB1) 的缺失已变成一个十分关键的治疗靶点，基于此而研发的EZH2抑制剂他泽司，已进入临床应用[8]。虽治疗手段不断丰富，但手术、化疗以及放疗依旧是最主要的治疗方案[9]。免疫治疗等新的治疗方法已初步显示出潜在价值，因此开发能够精准预测预后且能指导治疗的生物标志物十分必要。
铁死亡属于一种特殊的细胞程序性死亡形式，其发生机制与铁依赖的脂质过氧化物累积有着紧密关联[10]。近年来，有关铁死亡的研究已成为细胞生物学和疾病机制领域的热点，已有研究表明铁死亡可抑制肿瘤生长[11]。Jiang等[12]研究发现，p53基因借助抑制SLC7A11的表达可以有效促进铁死亡的发生。除此之外，当CD8+T细胞处于激活状态时所释放出来的干扰素γ，同样具备下调肿瘤细胞SLC7A11表达的能力，进而促使肿瘤细胞发生铁死亡[13]。在部分存在化疗抗性的肿瘤中，铁死亡同样有着颇为复杂的生物学功能[14-16]。铁死亡作为一种新兴的细胞死亡方式，其与代谢、氧化应激之间存在密切相关性，其在STS这类代谢异常活跃的肿瘤中会比凋亡等其他方式发挥着更重要的作用，有可能凭借协同作用构建起调控网络，对STS的预后产生影响。本研究运用生物信息学方法，将STS样本的转录组数据以及临床信息加以整合，同时将其与铁死亡相关基因(ferroptosis-related genes, FRGs)的表达情况进行综合性评估，构建一个以FRGs为基础的STS预后模型，为STS患儿预后评估以及个体化治疗提供新的思路。
资料与方法 一、数据收集本研究采用公共数据库回顾性队列研究及体外细胞实验方法。训练集数据取自UCSC Xena/TCPA等平台，下载TCGA-SARC队列和GTEx队列的RNA测序图谱，从TCGA-SARC队列中获取256例样本、GTEx队列中获取911例正常软组织样本，并从cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)下载相应临床数据。从GEO数据库下载GSE30929中140例样本的转录组和临床数据，以形成独立的验证队列。本研究中的FRGs来自FerrDb数据库。
二、模型构建数据预处理采用tidyverse (v2.0.0) 和data.table (v1.15.4)。对所有FRGs进行单因素Cox回归分析，将P＜0.05的基因纳入后续分析。通过cv.glmnet函数进行10折交叉验证。预后模型构建采用glmnet (v4.1 — 8) 进行LASSO回归分析，采用survival (v3.8 — 3) 进行多因素Cox回归分析，所有分析代码均存档以确保可复现性。最终得出风险评分(Risk Score)公式如下：
| $ \text { RiskScore }=\sum\limits_{i=1}^n \beta_i X_i $ |
其中βi为风险系数，即第i个基因特征缩放后的回归系数，Xi为第i个基因在患儿中的标准表达值。为评估模型性能，使用timeROC (v0.4) 和survminer (v0.4.9)构建1、3和5年的受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，并计算相应的曲线下面积(area under the curve，AUC)。同时绘制Kaplan-Meier(K-M)生存曲线，采用Log-rank检验比较组间生存差异。高、低风险组之间风险评分的分布差异使用Wilcoxon秩和检验。选择6个基因的表达谱进行分析，使用stats包中的prcomp()函数执行主成分分析(principal component analysis，PCA)。
三、GO/KEGG富集分析功能富集分析使用clusterProfiler (v4.8.3)对单因素Cox回归初部筛选出54个与预后相关的FRGs进行基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。以P＜0.05作为显著性阈值，筛选出显著富集的生物学过程及信号通路。
四、模型验证采用GEO数据库中的GSE30929队列对预后模型进行验证。提取模型中的关键基因，利用与训练集相同的标准化方法，消除不同数据集之间可能存在的差异，同样以中位数为界将所有患者分为高、低风险组，通过ROC曲线、K-M生存分析、箱线图、C-index评估该预后模型的性能。
五、实时定量PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR)横纹肌肉瘤细胞系(A-204)与正常骨骼肌细胞系(human skeletal muscle cell, HSKMC)均购于武汉普诺赛。将HSKMC细胞培养于HSKMC专用培养基中，将A-204细胞培养于McCoy's 5A培养基中，在5% CO2和37℃的培养箱中培养。当细胞生长密度达到80% ~90%时进行传代，完成细胞传代后使用AG RNAex Pro RNA提取试剂(AG21102)从细胞中分离总RNA，样品RNA含量及纯度见表 1。根据制造商的方案进行逆转录，并将cDNA用作实时荧光定量的模板。采用Primer Premier 5.0和Beacon designer 7.8软件进行定量PCR引物设计，所用引物序列如表 2所示。每个样品重复3次，各个基因的相对表达水平以2 -[(实验组目的基因Ct-实验组内参基因Ct)-(对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct)] 进行计算。
| 表 1 HSKMC和A204的样品RNA含量及纯度 Table 1 RNA content and purity of samples in HSKMC and A204 |
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| 表 2 实时定量PCR引物与反应条件 Table 2 Real-time PCR primers and conditions |
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本研究生物信息学分析均在Rv4.3.1和SPSS 26.0中完成。采用Cox回归模型进行单因素、多因素分析，采用Wilcoxon秩和检验对两组风险评分的分布情况进行差异显著性检验，采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，采用Log-rank法比较生存曲线间差异。采用Graphpad Prism 8.0.1进行RT-qPCR结果绘图。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果 一、基于TCGA-SARC数据集构建预后模型将前置筛选出的6个系数非零的基因纳入到多因素Cox回归分析(表 3)，最终成功构建6个基因预后模型，风险评分公式为：RiskScore=(-1.255)× ADIPOR1+(1.047)×SLC16A1+(-0.959)×KAT5+(0.691)×HNRNPD+(0.611)×ACTL6A+(-0.553)×NFKB2。依据该公式对所有疾病样本进行风险评分计算，以中位数区分高、低风险组，绘制K-M生存曲线及PCA图(图 1、图 2)。从箱线图看出，高风险组和低风险组的风险评分分布完全分离，且高风险组患儿评分显著高于低风险组。ROC曲线说明，1、3、5年的生存率所对应的AUC值分别为0.862、0.822、0.845。经计算C-index为0.854。
| 表 3 多因素Cox回归分析结果及各基因风险分数 Table 3 Results of multivariate cox regression analysis and risk coefficients for individual genes |
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图 1 训练集TCGA-SARC的生存分析曲线 Fig.1 Survival analysis curve of training cohort (TCGA-SARC) 注 横坐标为随访时间(年)，纵坐标为生存率。蓝色曲线代表低风险组，红色曲线代表高风险组; 高风险组总生存率明显低于低风险组；P＜0.001 |
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图 2 6个预后风险基因的主成分分析图 Fig.2 Principal component analysis plot of six prognostic risk genes 注 PCA1与PCA2分别解释了总变异的15.95%和12.48%, 高低风险组样本在基因表达谱等诸多特征方面存在明显差异 |
对54个预后相关FRGs进行GO和KEGG富集分析(图 3)，发现其功能显著集中于肌肉系统与细胞外基质相关过程。从GO富集分析结果来看，这些基因主要是在肌肉系统发育这一方面有所富集，另外在细胞外基质组成以及DNA转录调控等功能上也有富集情况。而KEGG富集分析则进一步揭示这些基因在某些通路中的核心作用，如肌肉细胞的细胞骨架相关通路、钙信号通路以及神经活性配体- 受体相互作用等相关通路当中，这些基因都扮演着极为关键的角色。
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图 3 54个预后相关基因的生物学通路分析 Fig.3 Biological pathway analysis of 54 prognosis-associated genes 注 A: GO富集分析；B: KEGG富集分析(横坐标代表富集到该通路中的基因占输入基因列表的比例, 气泡的大小代表基因数量，颜色代表校正后P值) |
选取GEO数据库中GSE30929做预后模型的外部验证，从K-M生存曲线(图 4)以及箱线图看出，高、低风险组之间的差异较为明显，且其C-index达0.749。ROC曲线中1、3、5年的AUC值分别为0.676、0.718、0.630，同样表明该模型可对患儿的生存时间予以较为精准的预测。
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图 4 验证集GEO-GSE30929的生存分析曲线(P=0.007) Fig.4 Survival analysis curve of validation cohort (GEO-GSE30929)(P=0.007) |
RT-qPCR实验结果显示(图 5)，6个预后相关基因在A-204和HSKMC这两个细胞系中的表达水平呈现出明显差异。6个基因在实验组A204和对照组HSKMC中的相对表达量分别为：ACTL6A (1.000±0.011)，(0.485±0.036)；SLC16A1 (1.003±0.091)，(0.678±0.046)；HNRNPD (1.001±0.055)，(0.794±0.038)；NFKB2 (1.003±0.092)，(2.135±0.097)；KAT5 (0.430±0.033)，(1.003±0.097)；ADIPOR1 (0.471±0.010)，(1.000±0.018)，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。相较于HSKMC组而言，A-204组中ACTL6A、SLC16A1和HNRNPD基因的mRNA水平的表达量显著升高，NFKB2、KAT5、ADIPOR1基因的mRNA水平的表达量显著降低。
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图 5 6个预后风险基因的相对表达量情况 Fig.5 Relative expression levels of six prognostic risk genes 注 RT-qPCR实验结果，a：P＜0.01，b：P＜0.001, 每个样品重复三次 |
STS的预后存在很大差别，其中高危患儿的长期生存状况不容乐观。当下，STS的危险度分层主要是依据TNM分期、组织学分级、肿瘤大小、深度以及诊断年龄等因素来确定。因为STS对传统化疗的敏感程度有限，特别是对于晚期或者复发的患儿而言，其治疗效果往往不太理想，耐药以及复发依旧是导致治疗失败的关键因素[17-18]。靶向诱导癌细胞死亡的方法依然是目前公认最有效的抗癌治疗手段。本研究经单因素Cox回归分析发现，超过50%的FRGs与总生存率有关，富集分析显示，铁死亡可能通过影响肿瘤微环境(如细胞外基质重塑)以及细胞运动功能(肌肉系统相关通路)，进而对肿瘤的侵袭和转移加以调控。
本研究构建的预后模型包含6个FRGs(ADIPOR1、SLC16A1、KAT5、HNRNPD、ACTL6A、NFKB2)，该模型中多个基因与小儿STS的恶性进展密切相关。例如，ACTL6A (肌动蛋白样蛋白6A)属于高度保守的BAF染色质重塑复合物的核心ATP酶亚基之一，其在A-204细胞系里高表达已得到证实，能借助推动上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)来驱动肉瘤发生转移[19]。这提示针对ACTL6A开展靶向治疗或许能够遏制小儿横纹肌肉瘤转移。SLC16A1(MCT1) 所介导的糖酵解重编程是肿瘤细胞的一个重要标志，使肿瘤细胞即便处在不缺氧的状态下，也会更偏向于高速率糖酵解活动，进而产生大量乳酸。该基因高表达与肿瘤的增殖、侵袭、转移以及不良预后之间存在密切关联，沉默lncRNA SLC16A1-AS1可通过miR-143-3p/SLC7A11信号传导在肾癌中诱导铁死亡，其抑制剂显示出与化疗的协同作用[20]。本研究凭借RT-qPCR实验确认了SLC16A1在肿瘤细胞系里的高表达情况。为进一步确定SLC16A1在铁死亡介导的STS中的功能，后续将通过功能缺失性实验来进一步验证。具体操作是在A-204细胞系中降低SLC16A1表达，且在后续使用铁死亡诱导剂(如Erastin)来处理细胞。除此之外，HNRNPD(AUF1) 作为一种RNA结合蛋白，已被证实是一种促癌基因，下调HNRNPD能够抑制肿瘤细胞的生长。
值得关注的是，乙酰转移酶KAT5在大部分肿瘤研究中表现为促癌作用，但在本研究中表现出抑癌基因的作用。在STS中，KAT5可能通过维持基因组完整及激活抑癌通路来抑制肿瘤发生。与此相关的研究表明，当KAT5出现耗尽状况时，可对p53激活BAX以及PUMA等基因的转录能力产生抑制作用[21]。这种“双重角色”的情况，除肿瘤类型存在差异这一因素之外，还可能是由于KAT5在STS特定调控网络中占据上游的枢纽位置。未来我们将联合运用免疫共沉淀以及质谱分析对KAT5在STS细胞中的相互作用加以鉴定，且对其针对特定底物所具有的乙酰化修饰功能展开验证，目的在于阐明由KAT5介导的、涉及表观遗传调控铁死亡的全新通路。此外，保护基因ADIPOR1与NFKB2可能通过调控AMPK信号和非经典NF-κB通路抑制肿瘤进展[22]。
本研究构建的6个基因预后模型在STS中首次问世，呈现出较好的预测性能，但其临床转化仍需进一步优化处理。在未来推广应用时，可以凭借石蜡组织RNA提取以及多基因表达检测平台(如RT-qPCR或者NanoString)来开展风险评分计算工作，同时结合最大选择法确定最为合适的cutoff值，从而达成更精准的风险分层效果。除此之外，本模型在和TNM分期、组织学分级等传统指标一同进行多因素Cox回归分析之后，仍旧维持着独立预后预测价值(P＜0.05)，说明其有着和传统指标联合应用的可能性。未来可构建包含风险评分以及临床病理特征的列线图，以进一步提高个体化预后判断的精确度。
利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突
作者贡献声明 潘雯婧、赵金都、高群负责文献检索；潘雯婧、赵金都负责实验过程；潘雯婧负责数据整理与分析、结果撰写与讨论分析；高群负责对全文知识性内容进行审读与修正
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