2026, Vol. 25
先天性巨结肠(hirschsprung's disease, HSCR)是一种由肠神经系统发育异常导致的先天性肠道动力障碍性疾病，其主要病理特征为肠神经节细胞缺如或发育不良，导致肠管蠕动障碍和功能性梗阻[1]。HSCR的发病率在新生儿中约为1 ∶ 5 000，存在显著的性别差异(男女比例约为4 ∶ 1)和种族差异(欧洲裔、非洲裔及亚洲裔人群的发病率分别约为1.5/10 000、2.1/10 000和2.8/10 000)[2-3]。HSCR发病机制复杂，涉及多基因、多信号通路的异常调控，包括以RET基因为主导的信号通路、EDNRB信号通路的功能缺陷，以及下游PHOX2B、SOX10等关键转录因子的调控失常。这些因素共同阻碍了神经嵴细胞的正常迁移、分化以及肠神经节的最终形成[4-5]。
近年来，环状RNA(circular RNA, circRNA)作为一类特殊的非编码RNA分子，逐渐成为研究热点。circRNA由线性前体mRNA经反向剪接(back-splicing)形成，呈闭合环状结构，具有高度稳定性、进化保守性及组织特异性等特征[6]。其通过充当分子海绵、调控转录剪接或编码多肽等方式，在包括神经发育在内的多种生命进程中扮演着重要角色[7]。尽管circRNA在神经系统及发育相关疾病中的研究不断深入，其在HSCR中的表达谱及作用机制仍然缺乏系统阐明。
本研究通过RNA测序分析HSCR与正常组织间circRNA的差异表达，结合qRT-PCR验证、生物信息学预测，系统探讨hsacirc_049751在HSCR中的表达及其潜在调控机制，为探索HSCR的分子发病机制提供新的线索和潜在研究方向。
资料与方法 一、研究对象本研究招募了70例受试者，包括35例HSCR病例(男27例、女8例)，为HSCR组；对照组35例(男25例、女10例)。HSCR组年龄(1.07±1.39)岁，对照组年龄(1.00±0.54)岁，两组年龄差异无统计学意义(P>0.05)。所有样本严格遵循统一的取材标准：HSCR组取材于满足HSCR诊断标准的患者术中切除的扩张段组织，对照组取材于因非慢性便秘疾病行肠道手术且病理检查无异常的组织样本。取材过程中避开炎症及坏死区域，并通过组织病理学评估确认用于RNA提取的组织样本无明显急性或慢性炎症表现。RNA质量方面，所有样本的RNA完整性数(RIN)均大于7.0，且A260/A280比值在1.8~2.1之间，符合高通量测序及qRT-PCR实验要求。
HSCR组和对照组分别随机选取5例患儿样本用于高通量测序，另外30例HSCR和30例对照组样本用于qRT-PCR验证circRNAs差异表达。本研究所有参与者均为汉族血统的生物学无关个体。HSCR组与对照组年龄及性别分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表 1。所有患儿经病史、钡剂灌肠、术中冰冻切片及术后病理检查确诊，均无家族史及其他消化道畸形。本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》原则，并已获得上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理审查委员会审核批准(XHEC-C-2016-263)。参与者父母均知情并签署知情同意书。
| 表 1 受试者临床特征 Table 1 Clinical characteristics of the subjccts |
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为构建HSCR circRNA差异表达谱，本研究随机选取5例HSCR患儿及5例对照患儿的肠组织样本进行高通量测序。采用Illumina HiSeq平台进行高通量RNA测序，提取总RNA，经rRNA去除后建库测序。使用DESeq2软件进行差异分析，筛选标准为|log2FC|>1，P < 0.05。
(二) hsacirc_049751表达的qRT-PCR检测为检测hsacirc_049751的表达水平，本研究收集了30例HSCR患儿及30例正常对照患儿的肠道组织样本。使用TRIzol试剂(TaKaRa Bio，日本)提取总RNA，并依照试剂盒说明将其逆转录为cDNA(TaKaRa Bio，日本)。采用BeyoFastTM SYBR Green qPCR Mix(Beyotime Biotechnology，中国上海)在QuantStudio系统上进行实时荧光定量PCR分析。以β-ACTIN作为内参基因，通过2^-ΔCt法计算circRNA的相对表达量。引物序列如下：hsacirc_049751正向引物为5′-ACAGTTGTTGGTCTTGACGA-3′，反向引物为5′-TTTCAGCCCTTGTGCCATTAAA-3′；β-ACTIN正向引物为5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，反向引物为5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′。
(三) 细胞培养与转染本研究使用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为HSCR的体外模型。细胞在含10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素-链霉素(PS)的DMEM/F-12培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2，并定期使用胰蛋白酶进行消化传代。
hsacirc_049751的特异性抑制剂(inhibitor)及其阴性对照(random control)，以及hsacirc_049751的过表达质粒和相应空载对照(mock control)购自上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma，中国上海)。所有转染实验均采用LipofectamineTM 2000转染试剂(ThermoFisher Scientific，美国)并严格按照说明书进行操作。
(四) 细胞愈合实验(wound healing assay, WHA)SH-SY5Y细胞在转染前1天接种至6孔板，待细胞汇合度达约90%时，次日使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific，美国)进行转染：分别转染hsacirc_049751抑制剂及其阴性对照，或hsacirc_049751过表达质粒及其对照。转染48 h后，用1 mL移液枪头在单层细胞上划出一条线性划痕。用PBS轻柔洗去贴壁细胞后，将培养物继续置于无血清培养基中培养24 h。使用倒置显微镜分别于0 h和24 h拍摄图像，并通过ImageJ软件对伤口闭合面积进行量化分析。每个实验独立重复3次，最终将迁移能力数据与对应对照组进行标准化处理。
(五) 生物信息学分析基于竞争性内源RNA(ceRNA)机制假说，为系统阐明hsa_hsacirc_049751-miR-516b-GDNF/GFRA3调控轴，本研究进行了系列生物信息学验证。具体而言，借助CircInteractome数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/mirna_target_sites.html)分析了hsa_hsacirc_049751对miR-516b的吸附能力；同时，利用TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/vert_80/)鉴定了miR-516b与GDNF、GFRA3基因3'UTR区的结合位点，并对其种子区互补性及热力学结合自由能进行了评估。
(六) 统计学处理采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据统计分析。连续变量以x±s表示，组间差异通过两独立样本t检验进行评估。计数资料以例数(%)表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果 一、HSCR患儿肠组织circRNAs表达谱的构建采用Illumina HiSeq平台对肠组织样本进行RNA测序，成功构建HSCR患儿的circRNAs表达谱(测序图结果尚未发表)。初步分析结果显示，与正常对照组相比，HSCR组织中存在多个显著差异表达的circRNAs，提示circRNAs的广泛表达失调可能与HSCR的发病机制相关。
二、hsacirc_049751在HSCR组织中显著下调为了验证初步筛选出的候选circRNAs，本研究在扩大后的独立样本队列(HSCR组和正常对照组各30例)中，通过qRT-PCR进行了验证(图 1)。结果显示，hsacirc_002483与hsacirc_049751在HSCR组织中的表达水平显著低于正常对照组(P < 0.05)，而hsacirc_038418在两组间未见显著差异。比较不同circRNAs的表达下调程度后发现, hsacirc_049751的下调最为显著，因此，将其作为HSCR发病相关的潜在circRNA，并用于后续机制研究。图 1为通过qRT-PCR在30对HSCR与对照组中验证候选circRNAs。
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图 1 候选circRNAs在独立队列中的表达验证 Fig.1 Expression verification of candidate circRNAs in an expanded cohort |
本研究在SH-SY5Y细胞中进行了WHA实验。结果显示，敲低hsacirc_049751后，细胞的划痕愈合速度明显减慢，迁移能力下降；相反，过表达hsacirc_049751可显著促进细胞愈合与迁移，其速度明显快于对照组(图 2A、图 2B)。
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图 2 hsacirc_049751对SH-SY5Y细胞迁移能力的影响 Fig.2 hsacirc_049751 promoted migration in SH-SY5Y neuroblastoma cells 注 A：WHA实验测定，SH-SY5Y细胞分别转染hsacirc_049751敲低及过表达以及相应阴性对照72 h后制备划痕，继续培养24 h，于0 h和24 h观察并采集图像；B：细胞迁移能力定量分析结果，通过ImageJ软件量化划痕愈合面积，各组细胞迁移率均以相应对照组为基准进行归一化处理, 数据以x±s表示，差异经t检验计算，a: P < 0.01, b: P < 0.001 |
为深入探究hsacirc_049751在HSCR中的分子调控机制，本研究通过系统的生物信息学分析构建潜在的ceRNA调控网络。首先，利用CircInteractome数据库预测hsacirc_049751的潜在结合miRNAs，结果显示，hsacirc_049751可与多个miRNAs结合，其中miR-516b的结合评分高且与hsacirc_049751有两个结合位点，提示二者之间存在强烈的相互作用潜力。进一步通过TargetScanet al.算法对miR-516b的靶基因进行预测，结果显示多个与肠神经系统发育密切相关的基因，包括GDNF及其受体GFRA3，其3'UTR区域均存在miR-516b的保守结合位点(图 3A、图 3B)。这些预测性分析结果提示，hsacirc_049751或许能作为miR-516b的潜在竞争性内源RNA，进而可能影响GDNF/GFRA3信号，由此提出一个有待验证的假说：hsacirc_049751-miR-516b-GDNF/GFRA3可能构成一个与HSCR相关的潜在ceRNA调控网络。
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图 3 hsacirc_049751-miR-516b-GDNF/GFRA3调控网络的生物信息学预测 Fig.3 A putative ceRNA cascade involving hsacirc_049751 and miR-516b targeting GDNF/GFRA3 in Hirschsprung's disease 注 A：基于CircInteractome数据库的预测结果，由SRplot在线平台生成circRNA与miRNA相互作用网络图。中心节点代表hsacirc_049751，周围节点代表预测可与其结合的miRNAs。在所有候选miRNA中，hsa-miR-516b因被预测拥有两个独立的结合位点(由连线表示)而被选中进行后续研究，这通常意味着两者之间存在更高的亲和力与更可靠的相互作用潜力; B：基于TargetScan数据库(v8.0)的预测结果，由SRplot平台生成的miRNA与靶基因相互作用网络图。中心节点代表hsa-miR-516b，周围节点代表其预测的靶基因。选择靶基因GDNF和GFRA3进行验证，是因为它们的3'非翻译区均含有miR-516b的保守结合位点，且是调控肠神经嵴细胞迁移的核心通路-GDNF/RET信号通路的关键组成部分 |
本研究首次通过RNA测序结合独立样本验证，发现环状RNA hsacirc_049751在HSCR组织中显著下调，提示其可能与HSCR发病进程相关。生物信息学预测分析提示，hsacirc_049751或许能够吸附miR-516b，其表达变化可能与GDNF/GFRA3信号通路的活性存在关联。这一发现具有重要意义，因为GDNF/RET信号通路是调控肠神经嵴细胞(enteric neural crest cells, ENCCs)存活、增殖与迁移的核心通路，而该通路功能障碍是HSCR发病的关键分子基础[8]。
本研究首次系统证实了hsacirc_049751在HSCR中显著下调，并通过扩大样本队列验证了其表达水平，同时基于生物信息学数据和初步功能关联，提出了“circRNA(hsacirc_049751)-miRNA(miR-516b)-候选靶基因(GDNF/GFRA3)”的潜在相互作用网络假说。这一潜在相互作用假说的提出，为传统以RET、EDNRB等关键基因为核心的HSCR分子病理学框架提供了重要的转录后调控层面补充。该机制模型为理解HSCR的复杂遗传表型提供了新的视角。值得注意的是，本研究预测的miR-516b可同时靶向GDNF及其受体GFRA3。GDNF通过与GFRα1/RET复合物结合激活下游信号级联反应，而GFRα3作为该家族成员，可能通过形成异源二聚体或竞争性结合方式参与信号的精细调控[9-10]。基于上述关联，本研究构建了如下工作假说以供未来验证：hsacirc_049751在HSCR中低表达，可能意味着其对miR-516b的潜在吸附能力下降，这或许会伴随游离miR-516b水平的相对升高，进而可能对GDNF/GFRA3信号产生潜在影响，最终可能不利于肠神经嵴细胞的正常迁移。这种分子层面的关联性异常，或许是HSCR病理发生的组成环节之一。
近年来，大量研究证实非编码RNA在肠神经系统发育及HSCR发病中具有重要调控作用。多种miRNA(如miR-146、miR-140)通过靶向RET、EGR2关键基因参与ENCCs的迁移与分化[11-12]；而circRNA因稳定、组织特异性及miRNA竞争结合能力，逐渐成为肠神经发育调控的重要环节。已有研究报道多种circRNA(如circANKRD12/circTIMMDC1、circMTCL1、circCCDC66)通过ceRNA机制参与肠发育及神经系统疾病过程[13-15]。本研究发现的hsacirc_049751可能通过吸附miR-516b，调控GDNF/GFRA3相关信号通路，从而影响ENCCs迁移与肠神经节形成，进一步拓展了circRNA在HSCR发病机制中的研究范畴。
本研究存在一定的局限性。①所提出的ceRNA调控轴主要基于生物信息学预测和初步的功能关联，其直接的分子相互作用，如hsacirc_049751与miR-516b的结合、miR-516b对GDNF/GFRA3的靶向调控等，尚需通过双荧光素酶报告基因、RNA Pull-down等实验直接验证。②本研究选用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为体外模型。该细胞系可被诱导分化为神经元表型，并被广泛用于研究神经细胞迁移、分化及相关疾病机制。此外，已有多篇SCI论文利用SH-SY5Y作为细胞模型，分析HSCR发病机制[16-17]。但其仍与原发性肠神经嵴细胞(enteric neural crest cells, ENCCs)在体内微环境上存在差异。③本研究缺乏体内动物实验证据来确认hsacirc_049751在整体动物水平对肠神经发育的影响。因此，未来研究工作将集中于利用原代细胞模型、基因编辑动物等手段，对这一新发现的调控轴进行深入的功能性与机制性探索。
综上所述，本研究发现hsacirc_049751在HSCR组织中显著下调，hsacirc_049751低表达可能与miR-516b及GDNF/GFRA3信号存在关联，并可能进一步影响神经发育过程；本研究结合单细胞转录组数据进一步验证了其靶基因在胚胎肠发育中的时空表达特征，为阐明HSCR的分子发病机制及探索新的诊断和治疗靶点提供新的理论线索。
利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突
作者贡献声明 王菊萍负责研究设计、数据收集与分析、论文撰写与修改；闫英男负责数据收集、统计分析；赵方正负责数据核实、统计评估；王阳负责研究指导、论文审阅与修改
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