先天性巨结肠相关性小肠结肠炎(Hirschsprung-associated enterocolitis, HAEC)是先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HSCR)最常见的并发症，临床表现为腹泻、腹胀、腹痛，甚至可出现中毒性巨结肠伴爆发性腹泻、直肠出血，严重者可出现休克甚至死亡，发生率为20% ~60%，病死率为1% ~10%^[1]。目前HAEC的治疗手段主要包括抗生素的应用以及肠道回流灌肠治疗，严重者需接受手术治疗。HAEC有反复发作的倾向，复发率为5.2% ~56.0%^[2]。研究表明HAEC发病与肠黏膜屏障破坏、肠道菌群失调、免疫应答异常、吻合口梗阻等因素有关^[1]。HAEC发作会导致肠道反复出现炎症性损伤，而HAEC的缓解离不开肠黏膜屏障的修复。肠黏膜的修复依赖于肠上皮细胞(intestinal epithelial cells, IECs)的再生，而肠道干细胞(intestinal stem cells, ISCs)是驱动IECs再生的主要原始祖细胞。本文旨在综述肠黏膜屏障的愈合机制及ISCs在其中发挥的潜在作用，为进一步了解HAEC肠黏膜屏障损伤修复提供帮助。

一、肠黏膜屏障的组成及其影响因素

儿童肠道的特点不完全等同于成人，具有肠壁薄、通透性高、屏障功能差，以及肠内毒素、消化不全的代谢产物和过敏原更容易经受损的肠黏膜屏障进入体内等特点，从而引起全身感染和变态反应性疾病。要研究肠黏膜屏障的损伤与修复机制，首先需要了解肠黏膜屏障的组成：正常的肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障组成，它们共同构建了一条防止肠内有害物质(如细菌、毒素)穿过肠黏膜进入人体的防线。因此，肠黏膜的功能状态与人体健康密切相关。

机械屏障主要由肠黏膜上皮层构成，肠黏膜上皮层作为肠黏膜屏障的最后一道防线，主要由IECs与其之间的紧密连接蛋白(tight junction, TJ)共同构成。IECs包括吸收性肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、M细胞、簇细胞以及潘氏细胞^[3]。这些细胞在肠隐窝以及小肠绒毛中以特定的空间关系排列，并由ISCs通过细胞分化补充。在肠隐窝底部有一个维持ISCs功能的部位，被称为干细胞生态位，通过隐窝的发育和进化，保护干细胞生态位免受肠腔中可溶性代谢产物的影响^[4]。当肠黏膜上皮损伤后，ISCs会分化出新的上皮细胞，逐渐向表面上皮或绒毛迁移，在损伤部位分化成所需的各种细胞类型。肠黏膜上皮通过ISCs的分化呈高度动态更新状态，每5~7天更新一次，从而持续保护肠道免疫细胞免受丰富的肠道微生物群影响^[5]。研究表明，在HAEC患儿中结肠病变部位可出现肠道通透性增加，这可能与细胞间TJ损伤有关^[6]。TJ由Claudins和Occludins蛋白构成，具有调控水和其他溶质通过肠黏膜上皮的作用^[5]。在TJ2过表达的动物模型中，表现为肠黏膜上皮的通透性大幅增加，而不会出现自发性肠炎。然而在敲除TJ7的小鼠模型中，肠黏膜上皮的完整性丧失，同时出现严重的肠道炎症表现。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)具有调控紧密连接的作用，其表达量的升高可导致IBD肠道的屏障功能丧失，Divertin小分子可阻断MLCK1破坏紧密连接，从而恢复肠道的屏障功能，限制IBD的进展。

肠道的生物屏障主要由肠道中定植的各种微生物构成，以细菌为主，研究报道人体肠道内有1 000余种细菌，与机体供体构成一个互惠共利的平衡生态系统。正常情况下，肠道细菌有助于肠道的营养吸收、消化功能。在感染、缺血、物理创伤或免疫介导损伤等各种因素的作用下，肠道细菌有可能改变生活习性，大量增殖、迁移，产生有害物质，从而扰乱机体的正常生理状态。肠道微生物群可以产生有活性的代谢产物(如三甲胺-N-氧化物、短链脂肪酸和胆汁酸等)，改变肠道稳态^[7]。肠道细菌也可以与IECs、免疫细胞和神经系统相互作用，作为元件参与细菌- 肠- 脑轴，共同维持肠道稳态^[8]。

肠道细菌驻留产生的抗菌物质以及胃酸、胆汁、消化酶、溶菌酶、黏液蛋白(mucoprotein, MUC)等抑制细菌黏附和定植的化学物质共同构成肠黏膜屏障的黏液层，也称化学屏障^[9]。杯状细胞分泌的粘液蛋白是构成黏液层的主要成分，与潘氏细胞分泌的防御素、抗菌酶、C型凝集素、核糖核酸酶、S100蛋白等共同组成限制肠道微生物群与肠上皮之间接触的物理屏障^[10]。黏液层在肠道上皮细胞之上形成一层保护层，保护其免受外部有毒物质、消化酶和细菌的侵袭。Thiagarajah等^[11]发现，HSCR患儿在发生HAEC之前，结肠杯状细胞数量增加，而其衍生的中性和酸性粘蛋白水平降低，这也可能是导致HAEC化学屏障损伤的因素之一。肠道的免疫屏障主要由肠道淋巴细胞、派伊氏结、肠黏膜分泌的免疫球蛋白及相关淋巴细胞等构成，能够诱导机体产生免疫应答，刺激分泌黏液，抵御外来侵袭。肠道中免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A, IgA)可通过靶向或中和细菌毒素来增强肠上皮的物理屏障，同时IgA也可以阻断IECs内微生物和毒素的穿梭^[12]。肠壁中的树突状细胞通过M细胞、杯状细胞、CX3CR1⁺巨噬细胞获得管腔抗原，进而迁移到引流区淋巴结，产生抗原特异性T细胞反应^[13]。而CX3CR1⁺巨噬细胞主要通过上皮细胞之间延伸的树突来直接捕获管腔抗原^[14]。肠道屏障受损的部位中性粒细胞募集，增加NAPDH氧化酶复合物的组装，从而产生抗菌氧化作用，以减少病原体在肠道的移位^[15]。此外，中性粒细胞在接触病原体时释放具有抗菌功能的细胞内颗粒(AMP、蛋白酶、金属螯合剂)，共同保护肠黏膜屏障免受损伤^[16]。肠上皮内淋巴细胞也参与维持肠道稳态和肠上皮修复作用，其中先天性淋巴结细胞3(innate lymphoid cells, ILC3)被认为是小鼠肠道再生的主要诱导剂^[17]。

二、肠黏膜屏障损伤的愈合机制

Deng等^[18]发现HSCR术后发生HAEC的患儿肠上皮屏障通透性显著增加，然而HAEC的肠黏膜屏障损伤愈合机制尚不清楚。既往研究表明，肠上皮微环境内的免疫细胞是诱导肠道组织再生的关键因素，对ISCs的增殖和IECs存活十分重要。损伤周围的肠黏膜上皮细胞受到细胞因子的调节，促进上皮迁移至病变处^[19]。此外，趋化因子受体及其配体趋化因子在没有细胞增殖的情况下调节IECs向病变处迁移^[5]。细胞因子以及Toll样受体和配体可激活转录因子和STAT3信号通路，从而诱导ISCs的存活和增殖。STAT3信号通路的激活对肠黏膜损伤的愈合至关重要，在小鼠模型中发现STAT3的失活可导致肠损伤愈合失败。STAT5基因敲除小鼠中发现激活上皮MLCK的表达，导致紧密连接功能障碍，从而影响肠黏膜上皮的损伤修复。STAT5过度表达会加快ISCs的增殖，从而加速损伤后的隐窝再生。巨噬细胞和淋巴细胞产生的细胞因子和可溶性介质(如PGE2和Wnt配体)可促进IECs增殖^[5]。巨噬细胞的凋亡清除也被认为是黏膜愈合的重要因素之一，在肠道损伤和修复的实验模型中通过C型凝集素受体吞噬凋亡细胞会诱导巨噬细胞表达抗炎因子，以及组织愈合因子。因此我们推测，巨噬细胞具有控制炎症扩散、促进肠道损伤修复的作用。

肠道微生物群也是肠道黏膜上皮损伤诱导组织修复的关键因素之一。肠道损伤后IECs的更新和再生能力下降，这表明微生物或其代谢产物的缺乏会对肠上皮稳态产生不利影响^[5]。与正常人群相比，HAEC患儿的肠道微生物群发生了较多变化，表现为肠道微生物多样性以及具有抗炎功能的细菌属(乳杆菌、双歧杆菌、粪杆菌)减少，而肠道致病性细菌属(大肠杆菌、艰难梭状杆菌)增多与HAEC患儿上皮损伤程度相关^[20]。因此，使用益生菌或粪便微生物群移植来恢复肠道微生物群的组成，是促进HAEC患者缓解的有益治疗策略。肠道的共生细菌(如鼠李糖乳酸菌)可刺激小鼠结肠上皮损伤附近的上皮细胞表达N-甲酰肽受体1(N-formyl peptide receptor 1, FPR1)^[21]。FPR是肠道稳态的关键调节因子，具有诱导上皮细胞增殖和迁移的功能^[22]。当肠道上皮损伤时，鞭毛细菌会激活TLR5，通过一系列反应诱导其产生IL-22，恢复肠上皮防御机制。同时IL-22可直接作用于小鼠和人类ISCs，触发STAT3激活，从而促进体外增殖并增加小肠类器官形成。此外，肠道厌氧菌产生氨基酸代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)也在肠道黏膜组织修复中发挥作用，SCFA丁酸盐可抑制小鼠ISCs的增殖，而其他氨基酸代谢产物(异戊酸、戊酸)则促进ISCs的增殖并维护肠黏膜屏障的功能。研究发现在HAEC患儿粪便中，SCFA含量明显降低^[23]。

三、肠道干细胞在肠道损伤中发挥的作用机制

ISCs的自我更新能力在维持肠道稳态、阻挡肠道微生物入侵和损伤修复中发挥着关键作用，适当调控ISCs可以保护肠道免受各种损害^[24]。IECs的更新是由位于隐窝底部、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5⁺(Lgr5⁺)的ISCs驱动^[25]。在稳态条件下，ISCs大多处于静止状态，导致上皮细胞的更新相对缓慢。然而在应激性损伤反应中，ISCs可在数小时内被激活，快速有效地修复受损上皮。这种反应可以在肠病原体感染时被观察到，也可以在DNA损伤、氧化应激或肠表面活性物质破坏时被观察到^[26]。同时，隐窝的独特结构可避免ISCs与消化过程直接接触，保护ISCs免受破坏，以维持干细胞增殖特性。研究发现在稳态状态下，EGFR信号通路对于ISCs增殖具有重要作用，EGFR下游激酶ERK的双重磷酸化参与维持ISCs稳态。EGF激活的ERK信号通路和ROS激活的JNK信号共同正反馈促进ISCs的增殖^[27]。这种特异性整合通过下游转录因子Fos与ERK、JNK响应位点上的双磷酸化实现。Ca²⁺信号是控制ISCs增殖信号整合的第二种机制，在ISCs中可以观察到胞质Ca²⁺的水平升高，以响应一系列促增殖信号通路的激活，并通过刺激CaN和CREB调节的转录共激活因子(cAMP-regulated transcriptional coactivator, CRTC)活性来触发ISCs增殖^[4]。

虽然感染、辐射、缺血、物理创伤或免疫介导的损伤等因素对上皮层造成的损害会促进修复过程，从而恢复上皮的屏障功能，但该过程需要ISCs在各种细胞因子调控下进行适当的空间分配^[28]。ISCs分化的信号通路[如Wnt、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)和Notch信号通路]之间相互作用可调控ISCs的增殖^[29]。简而言之，Wnt和Notch信号通路促进ISCs增殖分化为肠道祖细胞，而BMP信号通路充当调节剂，防止ISCs的过度分化和增殖，从而避免肠道肿瘤的形成^[30]。Wnt信号通路在肠道发育及稳态中扮演了非常重要的角色，包括Lgr5在内的许多ISCs标记物干细胞突出了Wnt信号的核心作用^[31]。Tian等^[32]研究发现维持正常的肠道干细胞稳态只需极低的Wnt信号水平，而向分泌细胞分化则需要较高的Wnt信号水平。潘氏细胞周围的肠干细胞表面与Frizzled受体结合的Wnt3，其浓度是干细胞增殖分化的主要驱动力之一^[4]。隐窝底部也有丰富的Wnt配体，但其激活Wnt信号通路的能力依赖于R-Spondins蛋白，它是肠干细胞维持增殖功能的另一个重要组成部分^[33]。BMP信号可以控制肠道干细胞的复制，通过抑制Wnt信号转导避免隐窝分裂和隐窝数量的过度增加。Kobayashi等^[34]通过直接诱导小肠上皮细胞受体Bmpr1特异性敲除BMP信号转导，从而阻断BMP信号转导，并检测到Lgr5⁺ISCs的显著扩增。PTEN通过PI3K-Akt介导BMP和Wnt途径，控制β-连环蛋白融合，从而确保对ISCs自我更新的平衡控制^[29]。

Notch受体和配体只在隐窝部位表达，决定小肠上皮细胞的自我更新和分化。Notch信号通路通过调控ISCs分化影响肠道内稳态，Notch信号通路激活会抑制ISCs向分泌型细胞分化，促进ISCs向吸收型细胞分化。通过Notch受体、配体敲除或γ-分泌酶抑制剂处理，特异性抑制小肠上皮细胞的Notch信号转导，可使所有小肠隐窝细胞迅速转变为分泌型细胞。Tian等^[32]发现Notch活性是维持隐窝中适当水平Wnt信号的必要条件，从而维持ISCs活性以及隐窝增殖。ISCs和祖细胞的增殖也通过Notch信号转导维持，抑制小鼠中的Notch信号转导将Lgr5⁺ ISCs转化为分泌细胞可能是通过激活Wnt途径完成，而隐窝中Notch的异位激活可导致增殖细胞的扩增，并抑制肠上皮中分泌细胞的产生。近年来研究发现，Hippo信号通路也在ISCs的分化中起一定作用。在正常情况下，Hippo信号通路通过控制YAP1和TAZ的活性调节ISCs，并维持祖细胞增殖。在应对肠上皮损伤的反应中，Hippo信号通路的上游成分(如MST1、MST1和SAV2)对YAP1和TAZ活性的负调控是维持正常肠道稳态和防止组织过度生长所必需的^[35]。

四、展望

干细胞目前是各种疾病的研究前沿，包括而不限于干细胞移植。目前肠道疾病的研究主要集中于炎症性肠病和肠道肿瘤，而在HAEC中的研究相对较少。目前全世界都在大力开展干细胞的相关研究，其瓶颈主要是干细胞来源的限制以及医学伦理的要求，国家尚未完全放开对干细胞研究的限制。其次，任何医学研究终将服务于人类生命健康，因此相关的临床试验也是我们未来面临的一大难题。但随着对ISCs的研究深入，我们相信干细胞对HAEC以及其他先天性疾病的发生、发展将发挥积极的治疗作用。

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