先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HSCR)是婴幼儿时期常见的先天性肠神经发育异常疾病，发病率为1/5 000~1/2 000，其主要病理特征为肠道远端神经节细胞缺如，从而导致肠道动力障碍。病情严重者可发生危及生命的先天性巨结肠相关性小肠结肠炎(Hirschsprung-associated enterocolitis, HAEC)^[1]。手术是目前HSCR的主要治疗手段，但术后仍有超过20%的患儿会出现HAEC、污粪等并发症，严重影响患儿生活质量^[2]。这一临床困境背后，是对HSCR发病机制的认识尚不充分，治疗手段亦存在局限。

既往HSCR研究多依赖组织病理学分析、全肠道组织测序及动物模型等传统技术，虽已鉴定出25个以上相关致病基因，明确了GDNF/RET/GFRα1及内皮素等多条通路的核心作用，但仍存在诸多瓶颈^[3-4]。传统技术只能获取不同细胞的平均化基因表达信号，难以揭示肠神经嵴细胞(enteric neural crest cells, ENCCs)及特定神经元亚群等稀少细胞的关键分子特征，亦难以准确识别疾病微环境中不同细胞类型的特异性变化。动物模型虽可在一定程度上模拟HSCR发病过程，但其遗传背景与病理生理过程与患者肠神经系统(enteric nervous system, ENS)的发育特征存在差异，使得大部分研究结论难以向临床转化，也无法准确还原HSCR发病过程中ENCCs迁移与分化障碍的分子调控网络^[5-6]。上述局限阻碍了对ENS发育过程中细胞与微环境相互作用动态变化过程的进一步探索。

单细胞测序技术的出现为破解上述难题带来了新的思路，该技术主要包括单细胞DNA测序、单细胞RNA测序、单细胞表观组学测序、单细胞蛋白质组学测序及单细胞多组学测序等^[7]。其中单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)应用最为普遍。该技术可以在单细胞层面检测基因表达水平，准确识别组织中不同的细胞亚群与功能状态，揭示细胞异质性^[8-9]，捕捉稀有细胞的分子信号，阐明细胞分化轨迹及细胞互作网络^[10-12]，为HSCR的病因解析、治疗方案研发及并发症防控提供了先进技术手段^[13]。然而，目前单细胞测序技术在HSCR研究中的应用成果较为分散，尚缺乏系统性梳理，本文围绕其核心应用场景展开述评，为该领域研究提供参考。

一、单细胞测序解析先天性巨结肠的发病机制

HSCR的发病主要是源于ENCCs迁移、增殖和分化障碍所致的肠神经节细胞缺如。该类对特定细胞群体动态变化的研究需求，与单细胞测序技术解析细胞异质性的核心优势相契合。传统研究虽已明确RET、EDNRB等核心基因与HSCR的相关性，但无法明确这些基因在特定细胞中的表达模式，也难以揭示细胞间异常互作的机制。单细胞测序技术突破了这一限制，支持并补充了HSCR多基因参与和多通路共同致病的理论。

单细胞测序技术在ENS发育研究中已取得许多进展。有研究结合空间转录组测序描绘了肠道单细胞图谱，绘制了人类肠道形态发生的时空细胞图谱，将ENS分为5个胶质细胞亚群和7个神经元亚群^[14]。后续研究进一步细化了分类，将ENS分分抑制性运动神经元、兴奋性运动神经元、固有传入神经元等功能亚群，明确A、B两条分化途径，精准描绘出孕6~17周ENCCs增殖分化为神经元的完整发育轨迹。其中，A分支细胞以高表达RET为特征，主要分化抑制性运动神经元及中间神经元。B轨迹细胞高表达ZEB2和EDNRB，主要分化为兴奋性运动神经元和初级传入神经元^[15]。通过结合scRNA-seq和空间转录组，研究人员学识别出波前ENCCs，并观察其在多个时间点多个部位的动态变化与核心特征，发现多个HSCR相关基因，提出Ephrin-Eph、Wnt-Frizzled、Sema3a-Nrp1通路在HSCR发病中的重要作用^[16]。上述研究还阐明了RET、EDNRB、SOX10等关键基因在不同细胞类型中的特异性表达模式，以及HOX家族转录因子在神经元亚型特化中的调控作用，为深入理解ENS发育提供了重要参考。基于既往对于ENS发育的探索，scRNA-seq分析发现HSCR患者和Ednrb^-/-小鼠肠道组织中ENCCs增殖亚群比例降低且分化异常，且与RET、EMB、NRG1/ERBB等信号通路表达异常密切相关^[16-19]。此外，狭窄段施万细胞样胶质细胞显著增多，而经典神经胶质细胞缺失，提示胶质细胞亚群失衡可能参与肠道微环境的继发性改变^[20-21]。

除肠神经相关核心细胞外，HSCR肠道微环境及其他肠道细胞的特异性改变也正逐步被解析^[22]。研究发现，肠道间质细胞存在显著的亚群重塑, 促血管生成基质细胞亚群(Fibroblast01、Stromal4)通过HIF-1α/VEGF轴激活促进远端结肠血管异常增生，间接影响ENCCs的迁移微环境^[23]；而TAGLN阳性肠平滑肌细胞与ENCCs的相互作用紊乱，可能破坏ENS发育中的间质-神经互作网络^[24]。

在分子调控机制方面，单细胞测序技术进一步完善了HSCR多基因、多通路共同致病的理论体系^[25]。拟时序发现，HSCR患者ENCCs分化轨迹出现中断，关键转录因子HDAC1核定位异常。其靶基因网络因此异常激活，从而抑制神经发生。另有研究发现，Sox10会通过调节Hoxa6的表达水平影响神经元的分化轨迹^[26]。ENCCs中的RNA剪接异常亦在HSCR中被发现，PTBP1外显子9的高包含率可引发PKM1/PKM2剪接失衡，导致细胞出现氧化磷酸化缺陷，进而影响ENCCs能量代谢与分化能力^[27]。此外，VCL基因突变所致细胞黏附异常、NRG1/ERBB3/ERBB2通路缺陷导致的细胞信号传导障碍亦被证实是HSCR的致病因素^{[18, 28]}。

单细胞测序技术突破了传统研究的平均化分析，可从单细胞水平研究HSCR发病的细胞异质性及分子网络异常，弥补了既往HSCR病因研究无法聚焦于ENCCs特异性变化及分化轨迹的不足。基于该技术，ENCCs亚群失衡及微环境异常已被证实在HSCR发病中发挥核心作用。然而，当前研究仍存在较多不足。一方面，神经元胞体较大导致单细胞捕获效率低，ENCCs等细胞数量过少，导致对核心细胞功能缺陷的解析不够全面。另一方面，虽有研究结合空间信息解析肠神经发育，但HSCR肠神经发育过程仍不明确，缺乏HSCR患者及小鼠模型的肠神经发育空间信息。另外，现有研究多为横断面分析，难以明确细胞或微环境异常与疾病发生的因果时序。未来研究可结合单细胞核测序与流式分选技术优化肠神经元及ENCCs的捕获和检测，结合空间转录组绘制HSCR患者和小鼠模型ENS发育的时空分子图谱，同时扩大样本量并开展纵向研究，为病因机制探索提供更全面的依据。

二、单细胞测序助力先天性巨结肠的精准治疗研发

目前HSCR治疗以外科手术为主，但术后并发症发生率高，缺乏有效药物治疗手段。细胞治疗被视为潜在替代方案，但现阶段存在细胞来源有限、定植效率低等问题，阻碍了其临床转化应用。单细胞测序技术有望为解决上述难题提供思路，推动HSCR治疗从手术矫治向精准化修复转变。其应用主要集中在种子细胞筛选、靶向型药物研发及治疗效果评估三个方向^[29]。

在细胞治疗领域，种子细胞的获取是关键难题。通过scRNA-seq发现，人多能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)经诱导分化得到的早期ENS祖细胞高表达SOX10、HOXB家族基因，具有神经分化潜能。将其移植到HSCR患者肠组织后，可迁移分化为功能性神经元和胶质细胞，显著改善肠道收缩功能，为细胞治疗提供了新的种子细胞来源。另外，HSCR患者无神经节肠段的施万细胞样胶质细胞已被证实存在神经发生潜能，可作为内源性修复的潜在细胞来源，为自体细胞治疗提供新思路^[20]。

在靶向药物研发方面，单细胞测序技术可明确关键分子，为药物筛选提供精准靶点。基于ENCCs发育过程中氧化磷酸化缺陷的发现，激活Hedgehog信号通路，可通过调控糖酵解与脂肪酸氧化改善线粒体功能，从而增强ENCCs的分化能力^[27]。对于施万细胞的神经发生潜能，GDNF和5-羟色胺受体激动剂普芦卡必利，能通过激活5-羟色胺受体4信号，诱导神经发生，在斑马鱼HSCR模型中改善肠神经节缺如的表型^{[20, 30-32]}。另外，HDAC1抑制剂、RET信号通路激活剂等潜在治疗药物亦根据单细胞解析出的分子机制被筛选出来，为HSCR的药物治疗带来了新的研发方向。

在治疗效果评估方面，单细胞技术可更精准地追踪移植后细胞的定植及功能状态。ENCCs移植治疗后，可借助单细胞测序精准分析移植细胞的分化轨迹、功能变化及其与微环境间的相互作用，推测细胞死亡原因及细胞间异常交流，分析移植后细胞分化路径，从而改进移植条件并调控分化方向，提高移植效率。此外，单细胞测序还可较精准地评估药物干预后目标细胞亚群的功能恢复情况及分子信号逆转状态，为治疗方案的调整提供可量化的参考指标，推动HSCR治疗逐步向个体化、精准化迈进^[33]。

单细胞测序技术为HSCR治疗的精准化提供了关键技术支持，但当前研究仍面临临床转化瓶颈。一是种子细胞移植后的长期存活、整合效率以及免疫排斥等问题缺乏系统研究。二是多数潜在药物仍停留在细胞或动物模型层面，缺乏临床样本的验证。且不同研究采用的技术标准不统一，药物靶点的可靠性存疑。三是HSCR病变肠段存在细胞外基质过度堆积等微环境异常，直接影响移植后细胞的定植、迁移以及分化功能，极大限制了治疗效果^[34-35]。因此，在进行细胞移植的同时，需同步改善肠道微环境，为移植细胞创造适宜的定植环境，以进一步提升细胞治疗效果。后续研究需结合单细胞技术，追踪评估移植细胞在体内的动态变化，进一步明确移植后细胞迁移障碍、分化方向异常、衍生细胞功能异常以及移植细胞死亡等问题的具体原因及分子机制，从而对现有细胞治疗方案做出调整改进。此外，尚需摸索原位转分化的可行方案，使非手术治疗成为可能；进行多中心大样本临床研究，验证靶向药物的实际疗效与使用安全性；完善标准化技术流程，以减少技术误差。

三、单细胞测序探索先天性巨结肠相关性小肠结肠炎的病理与预警

HAEC是HSCR最严重的并发症，其发病机制复杂，涉及肠道菌群紊乱、黏膜屏障损伤、免疫炎症反应等多个环节。传统研究虽已观察到明确的病理特征，但难以明确各环节的核心驱动因素，导致其始终缺乏有效的早期预警与治疗手段。

早期研究通过组织病理学检查发现HAEC患者肠道存在黏膜屏障损伤及炎症浸润，粪便宏基因组测序发现肠道菌群失衡，免疫学层面聚焦IL-6、TNF-α等炎症因子的整体升高，黏膜屏障研究仅证实CLDN1、OCLN等紧密连接蛋白表达下调致屏障功能障碍，却难以明确菌群、免疫细胞与肠道细胞的直接互作和特异性响应，也未能明确免疫细胞和杯状细胞等屏障相关细胞在驱动过程中发挥作用的具体亚型^[36-37]。

单细胞技术的应用为HAEC的病理机制解析提供了新视角。基于该技术的研究首先发现，HAEC患者肠道杯状细胞与潘氏细胞数量显著减少，丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型5(SPINK5)等与黏膜屏障功能相关的基因表达水平明显下调。细胞与分子层面的双重异常直接破坏了肠道屏障的完整性，使得肠道黏膜防御功能受损，为后续病理改变奠定了基础^{[22, 38]}。

肠道屏障完整性被破坏后，可引发一系列免疫微环境紊乱，具体表现为免疫细胞亚群重塑，记忆性B细胞、CD8-GZMK+T细胞增多，M1型巨噬细胞活化水平增强。紊乱的免疫细胞通过TLR4/p-p38/NF-κB信号通路，介导肠道过度炎症反应，加剧肠道组织损伤^[38]，M1型巨噬细胞增多可能通过诱导Cajal细胞表型转换引起肠道动力障碍，从而加重肠炎发生^[39]。另外，有研究识别出HAEC患者扩张段结肠中的簇状细胞数量减少，并提出这可能是M1型巨噬细胞异常增多的重要原因^[40]。

根据上述单细胞解析的分子特征，研究者筛选出HAEC的潜在预警标志物和治疗靶点，为该疾病的诊治提供基础。其中，HAEC患者肠组织中异常表达的IL-6、TNF-α等参与炎症反应的因子，CLDN1、OCLN等和屏障功能相关的蛋白，以及CD8A、CD19等免疫细胞标志物，ENCCs中COX7B、MDH1等氧化磷酸化通路基因异常表达，均可能与HAEC易感性相关，此类标志物可以作为HAEC早期诊断的候选指标。而基于Stromal 4细胞在HAEC发生中的作用，研究者发现布洛芬可以通过减少该细胞亚群比例并抑制促炎因子的释放，从而减轻HAEC的肠道炎症^[21]。这些特异性细胞和分子可作为HAEC治疗的候选靶点。

单细胞测序技术在揭示HAEC发病的细胞异质性与分子机制方面有着独特的优势，为HAEC的早期诊治提供新的思路。但当前缺乏HAEC炎症活动期的单细胞测序数据，无法捕捉急性炎症期的细胞动态变化及关键驱动亚群。既往识别出的潜在预警标志物未经过临床验证，特异度与灵敏度存疑，且尚未明确标志物水平与疾病严重程度、预后的关联。未来需重点开展HAEC活动期与缓解期的配对单细胞分析，明确HAEC发生的关键驱动细胞与分子通路。同时扩大临床样本量，进一步验证潜在标志物的临床价值，建立HAEC风险预测模型。此外，应基于解析的病理机制，开发针对肠道屏障修复、免疫炎症调控的靶向药物，为HAEC的精准防治提供新方案。

四、总结与展望

单细胞技术的出现为HSCR的研究提供了新的强有力的支撑手段，通过解析细胞异质性、揭示分子机制、鉴定治疗靶点，为HSCR的基础研究与临床转化搭建了关键桥梁。在病因机制研究中，明确了ENCCs亚群失衡和肠道微环境重塑的核心作用^[18]；在治疗领域，为细胞治疗中种子细胞筛选、靶向药物开发及治疗效果评估提供了新的手段，推动了HSCR治疗向精准化干预的发展；在HAEC研究中，通过揭示屏障障碍、免疫微环境紊乱及细胞间互作异常，为并发症的早期预警与治疗提供了新的标志物和靶点。

然而，当前研究仍面临稀有细胞检测不足、空间信息缺失、标准化程度低及样本量有限等挑战。未来，这些局限有待通过技术融合来突破，通过联合scDNA-seq，精准捕获核心细胞的特异性遗传变异，明确其与疾病表型的关联。结合空间转录组实现变异细胞的空间定位，借助单细胞表观遗传组学绘制HSCR发病中ENS发育的表观遗传动态图谱，揭示核心分子的表观调控网络。整合多组学数据，构建出涵盖“基因型- 表观型- 表型- 空间分布”的HSCR调控网络，为疾病精准诊断、细胞治疗策略优化及HAEC防控提供系统性支撑。同时，应加强基础研究与临床应用的紧密结合，增加临床样本量，开展多中心前瞻性研究，制定标准化技术操作流程，完善个体化精准治疗方案，验证疾病标志物的临床实用价值。

推动HSCR的诊疗工作真正进入个体化精准医疗阶段，不仅能显著降低术后并发症发生率，更能为患儿提供更具针对性的治疗与长期管理方案，从根本上改善预后，提升生活质量，为HSCR的防治带来新突破。

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