便秘是婴幼儿时期常见的排便功能障碍之一，分为功能性便秘和器质性便秘两大类。前者由非器质性病变引起，占儿童便秘的90%以上；后者由器质性病因导致，需治疗原发病才能矫治，临床常见的情况包括先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)及其同源病、肛门狭窄等。部分便秘依靠病史及辅助检查较难明确病因，需经直肠活检(rectal biopsy, RB)进行病理诊断。RB常用方式包括直肠黏膜吸引活检(suction rectal biopsy, SRB)及直肠全层活检(full-thickness rectal biopsy, FTRB)。FTRB多用于缺乏可靠的直肠吸引活检设备和熟练诊断技术的医疗单位，或通过SRB不能获取足够黏膜组织或经黏膜活检不能确诊的患儿^[1]。部分巨结肠同源病的诊断明确要求进行FTRB，而传统的FTRB采用同时切取黏膜层及肌层的方法，存在取材不能满足病理诊断要求的可能。我们应用直肠分层活检的方法分别获取黏膜层(含黏膜下层)和肌层，进一步提高了病理取材的达标率^[2]。

资料与方法 一、研究对象

回顾性分析2019年12月至2022年12月因顽固性便秘入住广州医科大学附属妇女儿童医疗中心胃肠外科的269例患儿临床资料。病例纳入标准：①根据罗马Ⅳ标准诊断为便秘，经口服药物、扩肛及回流灌肠等保守治疗后排便情况无好转；②24 h钡灌肠检查提示排钡功能延迟和或肛门直肠测压提示直肠抑制反射波不典型；③行直肠全层活检手术；④手术由同一组医师完成，病理诊断由2名固定的病理科医师完成^[3]。排除标准：①由先天性肛门直肠畸形、甲状腺功能减退、黏液性水肿、脊髓异常等疾病引起的便秘；②既往有肛管直肠手术史。

根据上述纳入和排除标准，本研究排除52例患儿，共217例患儿纳入研究。按照病理取材方式分为传统组和分层组。传统组92例，男61例、女31例，年龄(10.9±2.8)个月；分层组125例，男80例、女45例，年龄(10.4±2.7)个月。本研究经广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准(2023第114A01号)，患儿家属均知情并签署知情同意书。

二、研究方法 (一) 术前准备

术前1日晚及手术日晨行生理盐水回流灌肠，术前30 min使用第二代头孢类抗生素静脉滴注预防感染。

(二) 手术方法

①患儿采取全身麻醉+骶管阻滞麻醉后，取截石位，消毒铺巾，术者坐位于手术台尾侧，助手位于患儿右侧，器械护士位于患儿左侧；根据术者视线水平调整手术床头低脚高至合适程度，用肛门自动拉钩于齿状线上0.5 cm处充分牵开肛门，直肠腔内塞入纱布块辅助撑开肠腔并防止肠液污染术区；②消毒肠腔后于齿状线上5.0 cm处6点钟方向用4 - 0带针丝线悬吊直肠黏膜，使用针状电刀横向切开黏膜层约0.3 cm，向头侧及足侧钝性分离黏膜及黏膜下层至暴露白色肌层组织，切口两端预留4 - 0可吸收缝线，其中右端缝线带针；③如果黏膜及黏膜下层出血显著，导致无法直视判断肌层，可以通过悬吊带针丝线感受肌层的对抗感来帮助判断，用眼科剪分别剪取悬吊的肌层和黏膜(含黏膜下层)组织，预留缝线连续缝合切口；④同法于齿状线上3.0 cm处9点钟方向获取标本，取出直肠内纱布并留置油纱硅胶管(图 1)。传统法：于齿状线上3.0 cm、5.0 cm处6点钟方向用带针丝线同时悬吊直肠黏膜及肌层，用眼科剪剪取悬吊组织；其余步骤同分层法。

(三) 术后处理

患儿麻醉清醒后2 h饮水，4 h后进流质饮食，术后24 h内应用第二代头孢类抗生素预防感染，并复查血常规、C反应蛋白等感染指标以决定是否继续使用，术后4 h拔除油纱硅胶管。

(四) 病理学检查

切取组织行苏木精- 伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色及钙视网膜蛋白(calretinin, CR)免疫组织化学染色，观察肌间及黏膜下神经丛、神经节细胞的数量和形态。

(五) 观察指标

包括手术时间、术中出血量、术后住院时间、取材达标率(以取到的黏膜下层、肌层均满足病理诊断要求为达标)等。

三、统计学处理

采用SPSS 25.0进行统计学分析。年龄、手术时间、术中出血量、术后住院时间等服从正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用频数和构成比表示，两组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

两组均顺利完成手术，传统组与分层组手术时年龄[(10.9±2.8)个月比(10.4±2.7)个月]、术中出血量[(4.6±1.9)mL比(5.1±1.7)mL]、术后住院时间[(1.6±0.6)d比(1.7±0.5)d]比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；取材达标率[88.0%(81/92)比100%(125/125)]、手术时间[(29.3±6.6)min比(34.7±5.6)min]比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。两组分别有11例、14例术后出现低热，均无一例出现直肠穿孔、术后出血、直肠周围脓肿等并发症。见表 1。

传统组有81例取材达标，其中38例确诊为HD，9例诊断为巨结肠同源病，34例神经及肌肉组织未见异常；11例取材未达标，其中8例肌层组织不达标，黏膜下层病理检查可以观察到分布及发育良好的神经节细胞，但无法判断肌层情况；另外3例仅取到少量黏膜下层，未取到肌层，结合CR免疫组织化学染色可以观察到阳性神经纤维及个别神经节细胞，但无法判断神经节细胞的分布及发育情况，该3例患儿于术后2个月行直肠分层活检术，取材达标，神经及肌肉组织病理未见异常。

分层组取材均达标，53例诊断为HD，15例诊断为巨结肠同源病，57例神经及肌肉组织病理检查检查未见异常。见图 2。

讨论

1955年Swenson等^[4]首先介绍了直肠活检术应用于HD的诊断，其操作方法大致为纵行切开肛白线至肛柱之间的直肠黏膜后，再纵行剪取其下方0.5~1.0 cm的直肠肌层。该方法取材部位与目前建议的取材部位有较大出入^[5]。1979年Kadowaki等^[6]应用乙状结肠镜结合活检钳于最下方直肠瓣处取材，通过观察黏膜下神经丛进行鉴别诊断，该方法因操作简单而受到了欢迎，但由于婴儿直肠瓣不明显，因此可能造成短段型HD的漏诊。有学者对SRB技术进行了改良使其更适用于新生儿和年龄较小儿童^[7]。本文所介绍分层活检术是对Swenson活检方法的进一步改良。

有研究发现，齿状线上1.0 cm以内的肠壁神经节细胞和神经丛较为稀少，为避免诊断HD时出现假阴性，当前主流观点是在距齿状线1.0 cm以上取材，以2~3 cm为最佳^{[1, 5]}；且标本的直径不小于3 mm，黏膜活检时，黏膜下层的组织含量不少于1/3^[8]。Friedmacher等^[7]在其综述中提到SRB用于诊断HD时的取材达标率可以达到89.93%，约8.49%需重新行SRB。其在另外一项研究中报道SRB首次取材后重新行SRB或FTRB的中位发生率约10%(0~40%)^[9]。Redkar等^[10]对41例怀疑HD的儿童同时行SRB及FTRB，并结合乙酰胆碱酯酶染色(acetylcholinesterase, AchE)，前者的灵敏度和特异度分别为80.95%和90.00%，后者均为100%，其结论是FTRB更适合作为诊断HD的金标准，不建议根据SRB结果决定最终手术方式。

传统FTRB通过同时悬吊直肠黏膜及直肠肌层来获取较大体积的肠壁全层组织^{[6, 11]}。尽管如此，仍有约8%的患儿获取的组织量不能满足诊断要求^[12]。在最近的一篇大宗病例报道中，555例行FTRB取材的患儿中有33例(5.9%)不能达到诊断要求，但其只在直肠后壁齿状线上2~3 cm处取一处活检^[11]。本研究中传统组有8例(8.7%)肌层组织取材不足，导致无法对肌层组织进行分析，有3例(3.3%)黏膜下层及肌层组织均取材不足，只能依靠免疫组织化学方法辅助诊断，存在漏诊巨结肠同源病的可能。取材不足的原因主要包括以下3个方面：一是悬吊肠壁全层时深度判断错误，由于直肠黏膜层相对较厚，且黏膜下层组织也含有质地较坚韧的结缔组织，会给术者造成已悬吊肌层的错觉；二是术者担心造成直肠穿孔，剪取组织时未尽量向悬吊位置深处靠近，从而导致不能获取满意的黏膜下层和肌层；三是切取组织过程中创面出血，尤其是小动脉的出血使术野模糊并给术者造成压力，也会导致取材的不理想。

HD肠壁中存在特异的AchE和CR染色模式，CR染色仅需取黏膜层观察有无阳性神经纤维即可满足对HD的诊断，大大降低了取材要求，但是仅取黏膜层不能满足对巨结肠同源病这些需要通过直接观察神经节细胞形态进行诊断的疾病。其次，某些特殊类型的同源病，例如神经节细胞减少症的诊断需要进行全层活检^[13]。直肠分层活检能够保证获取充足的组织量，为该类疾病的病理诊断提供了可靠基础。分层组有2例诊断为神经节细胞减少症，经口服乳果糖、回流灌肠等保守治疗后便秘情况无好转，最后行经脐单孔腹腔镜辅助经肛门拖出术治疗。另外，本研究中部分排除病例为HD根治术后便秘复发患儿，经扩肛、灌肠等保守治疗无好转，通过直肠分层活检明确了病因^[14]。笔者的体会是，如该类患儿肛管无瘢痕狭窄，应优先考虑分层活检术以保证取材的成功，避免反复手术给患儿带来损害。

本研究中分层组手术时间明显长于传统组，差异有统计学意义(P＜0.05)，主要原因是传统组无分离黏膜、显露肌层和重新悬吊肌层的操作。目前尚无FTRB并发症的总结性文献报道，但在一项关于FTRB的大宗病例报道中其总的并发症发生率为6.6%，以发热为主，无一例因出血需要输血或直肠穿孔的病例，1例因直肠周围脓肿行肠造口术^[11]。传统组和分层组分别有11例、14例出现术后低热，无其他并发症发生。为避免术后并发症，患儿术前应洗肠至无陈旧性粪便，尤其是粪石，减少质硬粪块可能造成的伤口出血；对于年龄较大儿童手术前后可另予甲硝唑口服以预防感染；术后常规口服乳果糖等药物辅助排便，2周内避免洗肠或使用开塞露，如确需直肠侵入性操作，需在医师指导下进行。另外，患儿如术后1周内有血便、体温升高等表现，应及时就医排除手术切口出血或感染。

笔者总结直肠分层活检手术的经验：①助手使用无损伤长镊柄端推开直肠右侧壁，尽量展平操作点黏膜皱襞；②选用4 - 0带针缝线，既可以保证在肠腔内操作的灵活性及悬吊的深度，又可以减小对组织的切割作用；③切口处采用全层连续锁边缝合，不仅能有效控制肌层及黏膜、黏膜下层等出血，还可以降低缝合难度；④缝合结束后再次消毒肠腔，观察5 min后使用干净湿纱布块探查肠腔确认有无渗血。

综上所述，直肠分层活检可以明显提高取材的达标率，是顽固性便秘儿童病理诊断取材的可靠方法，可以避免因取材不足导致的病理诊断困难，以及二次活检给患儿造成的身体伤害和家庭经济负担，尤其推荐将该方法用于SRB或传统FTRB取材失败的患儿。本研究的不足之处在于为单中心研究，无法更准确地反映直肠分层活检术的并发症发生情况，之后的工作中需进一步扩大样本量并开展多中心对照研究，以进一步验证其安全性及可靠性。

利益冲突  所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明  兰梦龙、梁子建负责文献检索；曾纪晓、陶波圆负责论文设计；钟知足、林玉珍、林瑞燕负责数据收集；刘斐、徐晓钢、陶波圆负责研究结果分析与讨论；陶波圆、陈凯负责论文撰写；曾纪晓负责全文知识性内容的审读与修正