2024, Vol. 23
胆道闭锁是一种病因未明、以胆道系统进行性纤维增生、胆汁淤积和肝内外胆管系统阻塞为特征的疾病，如未进行手术，患儿可于2岁以内死亡[1-2]。即使接受了Kasai手术，也有部分患儿不能获得长期自体肝存活，需接受肝移植手术。胆道闭锁Kasai术后预后的影响因素一直是小儿外科临床与科研工作的热点。血清基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类参与细胞外基质重塑为主的Zn依赖性内肽酶，能够降解多种细胞外基质蛋白，也可处理一系列生物活性分子，在细胞信号转导、免疫调节等方面起作用[3]。MMPs在不同疾病条件下的过表达有其特异性，且能够在多种体液(血液、尿液或唾液)中被检测到，最近已被确认为多个领域(诊断、监测和疗效评估)的生物标志物[4]。胆道闭锁患儿预后与肝纤维化程度密切相关，而肝纤维化过程中涉及大量细胞外基质重塑，已有大量研究表明MMPs在其中发挥重要作用，利用胆道闭锁患儿术前血清MMPs来评估其预后有一定的临床意义。本研究利用多因子悬液芯片检测系统，检测胆道闭锁患儿术前血清MMPs系列蛋白的含量，比较术前血清MMPs系列蛋白含量与患儿手术时肝纤维化分级及术后黄疸清除率、早期胆管炎发生率、自体肝生存情况的相关性，探索胆道闭锁患儿预后相关预测因子。
资料与方法 一、临床资料本研究为回顾性研究，收集2017年3月至2018年6月在浙江大学医学院附属儿童医院新生儿外科诊疗的胆道闭锁患儿临床资料。病例纳入标准：①患儿家属同意入组；②术中胆道造影明确诊断为胆道闭锁；③在本中心治疗并规范随访。排除标准：①合并其他肝胆疾病；②临床资料不全。入组时患儿家属均已详细了解研究计划和采样流程，术前采血行血清MMPs含量测定，并签署知情同意书。收集患儿临床资料(包括病史、实验室检查结果、病理结果以及早期胆管炎发生情况、术后3个月黄疸清除情况、5年自体肝生存情况)。
共有38例患儿纳入本研究，其中男22例、女16例。3例术中造影确诊为Ⅲ型胆道闭锁后家属拒绝行Kasai术，仅行肝脏活检术；35例确诊胆道闭锁后行Kasai术及肝脏活检术。35例Kasai术后获随访患儿中，6例于术后1年内行肝移植手术，2例行Kasai术后因胆道闭锁相关并发症死亡，27例随防5年以上均自体肝存活。本研究已取得家属知情同意，经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会审批通过(2019-IRB-018)。
二、样本采集以及MMPs系列蛋白的检测采集患儿入院时全血置于EDTA-K2真空采血管中，颠倒混匀，以3 000 rpm转速离心10 min，将上清液分装于1.5 mL离心管中冻存于-80℃冰箱待用。制备检测样品及标准品后，上机检测，利用多因子悬浮芯片系统高通量检测血清MMPs含量。所用试剂盒为Human MMP Assays Kit(Bio-Plex Pro Human MMP 9-Plex#171AM001M，USA)，包括以下9个因子：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-12和MMP-13。
三、相关指标及定义胆管炎诊断标准：患儿有不明原因发热，体温超过38℃，同时伴有粪便颜色浅白，总胆红素升高并以直接胆红素升高为主，超敏C反应蛋白升高[5]。以上四项中符合三项或以上即诊断为胆管炎。
早期胆管炎：指Kasai术后1个月以内发生的胆管炎。术后3个月黄疸消退标准：术后3个月总胆红素 < 34.2 umol/L。
肝脏纤维化程度分级(采用日本Ohkuma's标准)：未出现纤维化为0级，肝门管区出现轻度纤维化为1级，出现附近门管区轻度桥接纤维化为2级，出现附近门管区中度桥接纤维化为3级，出现肝硬化、假小叶形成为4级[6]。0~2级为轻度纤维化组，3~4级为重度纤维化组。由两位资深病理科医师共同对患儿肝脏病理进行分析和记录。
四、随访时间及分组将Kasai手术当天视作随访起点，术后5年或患儿因胆道闭锁相关并发症导致死亡、失访或行肝移植治疗视作随访终点。根据是否发生早期胆管炎分为早期胆管炎组和无早期胆管炎组；根据术后病理检查肝纤维化程度分为轻度肝纤维化组和重度肝纤维化组；根据术后3个月黄疸清除情况分为黄疸消退组和黄疸未消退组；根据随访5年后自体肝生存情况分为自体肝存活组和自体肝未存活组。比较不同分组患儿的术前血清MMPs系列蛋白差异。
五、统计学处理应用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0进行统计学分析和制图，不同组别胆道闭锁患儿术前血清MMPs数值中服从正态分布的计量资料以 x±s表示，不服从正态分布的计量资料以M(Q1, Q3)表示。各组别中服从正态分布的计量资料比较运用两独立样本t检验，不服从正态分布的计量资料比较运用非参数检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果 一、轻度肝纤维化组和重度肝纤维化组患儿术前血清MMPs蛋白含量比较38例术中均行肝组织活检术，根据术后病理检查肝纤维化严重程度分组，其中15例为轻度肝纤维化，23例为重度肝纤维化。两组术前血清MMPs蛋白含量比较，MMP-7及MMP-13差异有统计学意义(P < 0.05)。重度纤维化组MMP-7蛋白水平明显高于轻度纤维化组，而轻度纤维化组MMP-13蛋白水平高于重度纤维化组，两组患儿其余MMPs含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
| 表 1 轻度肝纤维化组和重度肝纤维化组胆道闭锁患儿术前血清MMPs蛋白含量(pg/mL) Table 1 Preoperative serum MMPs protein levels in children with biliary atresia with mild vs. severe liver fibrosis groups(pg/mL) |
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38例中，3例确诊为胆道闭锁，但未进行Kasai手术；35例行Kasai手术，术后3个月复查血清总胆红素，15例达到了黄疸清除标准(总胆红素 < 34.2 umol/L)。根据术后3个月黄疸清除情况分为黄疸消退组和黄疸未消退组, 两组患儿术前血清MMPs蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
| 表 2 黄疸消退组和黄疸未消退组胆道闭锁患儿术前血清MMPs蛋白含量(pg/mL) Table 2 Preoperative serum MMPs protein levels in children with biliary atresia with jaundice resolution vs. non-resolution groups(pg/mL) |
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随访35例行Kasai手术患儿，根据术后1个月内是否有胆管炎发作分为早期胆管炎组与无早期胆管炎组，两组术前血清MMPs蛋白含量比较，仅MMP-7差异有统计学意义(P < 0.05)，早期胆管炎组MMP-7含量高于无早期胆管炎组，其余MMPs蛋白含量差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
| 表 3 胆道闭锁早期胆管炎组与无早期胆管炎组患儿术前血清MMPs蛋白含量(pg/mL) Table 3 Preoperative serum MMPs protein levels in children with biliary atresia with early cholangitis vs. non-cholangitis groups(pg/mL) |
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38例确诊为胆道闭锁患儿中，3例拒绝行Kasai手术，自行出院后失访。35例完成Kasai手术的患儿中，6例于术后1年内行肝移植手术，2例在术后3年内因胆道闭锁相关并发症死亡，27例随防5年以上均自体肝存活。将自体肝存活组和非自体肝存活组(移植和死亡)比较，发现两组患儿术前血清MMPs系列蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。见表 4。
| 表 4 非自体肝存活组和自体肝存活组胆道闭锁患儿术前血清MMPs蛋白含量(pg/mL) Table 4 Preoperative serum MMPs protein levels in children with biliary atresia with native liver survival vs. non-survival groups(pg/mL) |
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胆道闭锁肝纤维化和肝硬化的发生发展是一个复杂过程，需要许多细胞因子参与，正常肝脏细胞外基质成分相对较少，而肝纤维化正是细胞外基质大量增加导致广泛组织重构的结果。负责降解这些细胞外基质和基底膜的所有蛋白成分的关键酶是MMPs。很多学者已经研究了MMPs在肝纤维化中的表达谱，但结果不尽相同，显然这与肝纤维化的原发病和不同检测方法有关[7-8]。多因子悬液芯片系统是一个用于单孔中分析多种蛋白、肽和核酸的系统，能获得可靠的高通量多重检测结果，相较于普通ELISA方法，既省时间又省样品。本研究对胆道闭锁患儿术前血清MMPs系列蛋白进行检测，根据胆道闭锁手术后不同结局进行分组，探寻患儿术前血清MMPs系列蛋白含量与术后不同结局之间的关系。
根据MMPs活性以及底物范围，人们将具有相似的结构和功能特征的MMPs进行分组，至少有28组MMP，其中24组已知在人类中表达。根据结构生物信息学大致分为几类：经典胶原蛋白酶(包括MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-10、MMP-12、MMP-13等), 主要功能是切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等纤维胶原蛋白；明胶酶(包括MMP-2、MMP-9等)，主要降解ECM蛋白；膜结合MMPs(包括MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-24等)，在细胞表面表达活性形式；基质溶解素(包括MMP-7、MMP-26等)和间质溶血素(包括MMP3、MMP10、MMP11等)[3]。
Kasai手术时肝纤维化程度是胆道闭锁预后的独立影响因素，也是判断长期预后的指标之一[9]。本研究发现胆道闭锁患儿术前血清MMP-7和MMP-13水平与肝纤维化严重程度相关，重度肝纤维化组术前血清MMP-7蛋白水平明显高于轻度肝纤维化组。而术前血清MMP-13水平则相反，重度肝纤维化组低于轻度肝纤维化组，差异有统计学意义(P < 0.05)。MMP-7是一种基质溶解素，由胆管上皮细胞、肝巨噬细胞和肝细胞产生，在正常肝组织中弱表达而在进行性肝纤维化反应肝脏中表达明显上调。本研究结果和Jiang等[10]报道的结果一致，术前血清MMP-7水平与肝纤维化分级相关，肝纤维化程度越高，MMP-7越高。虽然MMP-7参与胆道闭锁病理生理学的机制尚不清楚，但MMP-7已在其他纤维化病理学(如肾和特发性肺纤维化)研究结果中表明，MMP-7参与Wnt/β-catenin信号传导，通过脱落E-钙粘蛋白减少细胞间接触，通过骨桥蛋白和TNF-α放大炎症和纤维化，同时它似乎也在诱导血管生成中发挥作用[11]。MMP-13是胶原酶的一种，研究表明MMP-13可以切割Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ和ⅪⅤ型胶原蛋白和纤连蛋白。MMP-13在细胞外基质降解和细胞- 基质相互作用的调节中起关键作用。有研究指出MMP-13还可以通过高表达来介导肝细胞生长因子、MMP-2、MMP-9的表达来诱导胶原纤维降解[12]。有学者将MMP-13基因注入小鼠胆管结扎模型，发现小鼠血浆AST恢复，并有利于肝脏纤维化降解。MMP-13是阻止肝纤维化形成的重要因子，被认为可能是肝纤维化治疗中的潜在靶点[13]。研究发现术前血清MMP-13在轻度肝纤维化组中含量更高，MMP-13的上升意味着分解代谢活动增强，从而肝纤维化程度好转。
有一些MMPs能够通过调控趋化因子进而召集免疫效应细胞至损伤部位，以此来促进炎症反应，还有的MMPs能通过调节生长因子活性和物理屏障的完整性来调节炎症反应。本研究发现，早期胆管炎组术前血清MMP-7含量高于无早期胆管炎组，差异有统计学意义(P < 0.05)。MMP-7与胆道闭锁的密切关系提示MMP-7在疾病的发病机制中具有潜在的作用。有学者在小鼠实验性胆道闭锁模型中，通过轮状病毒损伤肝外胆管后，发现血清MMP-7升高，直接证明了这种可能性[7]。此外，MMP-7可能通过切割E-cadherin和破坏黏附连接来调节组织修复，促进细胞迁移，并通过激活Fas配体和潜在的TNF-α调节炎症[14]。
本研究比较了术后3个月黄疸消退组和黄疸未消退组、术后5年自体肝存活组和非自体肝存活组患儿术前血清MMPs蛋白含量，MMPs作为黄疸清除情况和远期自体肝生存情况的预测指标研究较少，本研究的组间差异均无统计学意义，但并不意味着基质金属蛋白酶在胆道闭锁病情进展中未发生作用，也可能与病例数或标本来源因素有关。本研究结论对于确定MMPs系列蛋白对胆道闭锁预后的预测效用有重要意义。其局限性在于病例数较少，且缺乏术后血清MMPs蛋白的检测，缺乏MMPs动态变化监测。
利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突
作者贡献声明 韩一江、赵晓霞负责文献检索，黄寿奖、秦琪负责论文设计，方舒、赖登明负责数据收集，陈锐、吕成杰负责研究结果分析与讨论，胡书奇负责论文撰写；钭金法负责全文知识性内容的审读与修正
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