2022, Vol. 21
2. 浙江大学医学院附属儿童医院内分泌科、国家儿童健康与疾病临床医学研究中心, 杭州 310052
2. Department of Endocrinology, Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, National Clinical Research Center for Child Health, Hangzhou, 310052, China
儿童囊性肾瘤(pediatric cystic nephroma, pCN)是一种罕见的儿童良性肾脏肿瘤，发病率尚不明确，最初儿童囊性肾瘤与囊性部分分化性肾母细胞瘤一样被认为是Wilms肿瘤谱中的一种类型。近十年的研究发现，儿童囊性肾瘤的发生与DICER1的胚系突变或体细胞突变相关，这一点区别于囊性部分分化性肾母细胞瘤和成人囊性肾瘤，2016版WHO肾肿瘤分类中，将儿童囊性肾瘤单列为一种肿瘤类型[1]。1996年，Priest等[2]报道了儿童胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonary blastoma, PPB)患者家族存在发育不良或肿瘤易感性，Boman等[3]在2006年研究发现约12%的PPB儿童同时患有囊性肾瘤，Hill等[4]在2009年通过家系分析发现，PPB家族性肿瘤易感综合征与DICER1基因遗传突变有关。Doros等[5]在2014年通过遗传分析证实DICER1基因突变与儿童囊性肾瘤相关。DICER1基因突变可致多种肿瘤，其中儿童最常见的是PPB和pCN。本文报告1例儿童囊性肾瘤伴DICER1突变的病例，并通过文献回顾提高临床对此类疾病的认识。
材料与方法患儿女，1岁1个月，2020年11月因“左腹部膨隆3 d”入院，体格检查：左侧腹部膨隆，可扪及包块，触诊韧，无压痛，余腹部质软，未扪及压痛及包块，肝脾未及肿大，双侧腹股沟未及包块。B超提示“左肾中下极约10.8 cm×9.7 cm×8.9 cm囊实性包块，囊性为主，与左肾分界不清，周边见少许肾皮质回声，包块内实质探及少许点状血流信号，右肾未见异常”(图 1)。
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图 1 儿童囊性肾瘤B超图像 Fig.1 Ultrasonic image of left kidney tumor. 注 左肾中下极约10.8 cm×9.7 cm×8.9 cm囊实性包块，囊性为主 |
腹部增强CT提示“左肾体积显著增大，其内见一巨大类圆形囊性占位，大小约9.55 cm×9.13 cm ×10.51 cm，可见分隔，呈蜂窝样改变，边界清，增强CT扫描可见囊壁及分隔强化；左肾动静脉未见明显变窄，右肾未见异常”(图 2)。腹部磁共振平扫提示“左肾巨大占位性病变，大小约8.9 cm×9.4 cm×10.7 cm，肿块后方及内侧见少许残留正常肾组织影，呈抱球征改变，肿块边缘光整，肿块内呈广泛多囊样改变，囊腔内大致呈长T1、长T2信号，腹主动脉及下腔静脉向右侧推移，未见肿块包绕，腹膜后未见淋巴结增大，右肾未见异常”(图 3)。B超、增强CT、磁共振平扫均提示左肾囊性部分分化性肾母细胞瘤。肺部CT平扫提示，两肺下叶背侧胸膜下似见少许模糊淡片状影，考虑坠积效应；右肺下叶内可见小囊状透亮区，考虑间隔旁小气肿。本研究经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会审核批准(2021 - IRB - 154)，并获得患儿家长的知情同意。
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图 2 儿童囊性肾瘤腹部增强CT图像 Fig.2 Contrast-enhanced CT image of left kidney tumor A：平扫; B：动脉期; C：静脉期; D：冠状位; E.矢状位 |
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图 3 儿童囊性肾瘤腹部MRI平扫图像 Fig.3 MRI plain scan of left kidney tumor A：T1相; B：T2相; C：冠状位 |
完善术前准备后，于全身麻醉下行儿童囊性肾瘤切除术，术中见左肾包膜张力高，表面未见明显曲张血管，与肾周组织分界较清，无明显炎症粘连，完整切除左肾及左侧输尿管，肾蒂旁及腹主动脉旁未见明显肿大淋巴结。术中出血约5 mL，手术顺利。围手术期未进行放疗及化疗。经患儿家长同意，获取患儿肿瘤组织及外周静脉血(EDTA抗凝)。使用通用型基因组柱式提取试剂盒(天根)提取组织DNA，使用血液基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)提取样本DNA，使用Nanodrop 2000对DNA进行质检，质检合格后进行下一步实验。
使用标准文库构建试剂盒(迈基诺)进行基因组文库构建。本研究采用目标序列捕获探针(MyGenostics, GenCap)对相关基因外显子及其上下游50 bp区域进行捕获, 将构建好的基因组文库与经过生物学标记的目标区域捕获探针进行杂交，用链霉亲和素修饰的磁珠共价结合生物素标记的探针，从而抓取目的基因。最后用磁力架吸附携带目的基因的磁珠，洗脱纯化，富集目标区域DNA片段。借助华大DNBSEQ-T7测序仪对捕获的外显子区域进行高通量测序。
去除原始测序数据中的污染和接头序列，然后利用BWA软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列(hg19)上。利用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出单核苷酸变异(single nucleotide variation, SNV)和插入缺失突变(inserts and deletions，INDEL)的相关信息。通过ANNOVAR软件(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对所有的SNP和INDEL进行注释。筛选正常人数据库中频率小于0.05的突变位点，正常人数据库包括千人基因组计划和外显子组整合数据库(Exome Aggregation Consortium, ExAC)等。错义突变使用REVEL(Rare Exome Variant Ensemble Learner)、SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)、PolyPhen-2、MutationTaster和GERP++等软件进行致病性和保守性预测，剪切位点的改变用SPIDEX等软件分析其致病性。结合疾病遗传模式和患者临床表征进行综合分析，筛选出可疑候选变异。利用PCR和Sanger测序验证经分析筛选后得到的候选变异位点。利用Primer 3.0在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计PCR引物。PCR扩增产物使用3130XL测序仪进行毛细管电泳测序，并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上进行分析。
以“囊性肾瘤(cystic nephroma)”“DICER1”为关键词，在PubMed、万方、中国知网等数据库进行检索。检索时间截至2021年5月。
结果 一、病理检查结果肾脏全切标本，大小约13 cm×10 cm×9 cm，切面见多个囊腔，直径0.5~2.0 cm，囊内为黏液或清亮液体，与肾皮质分界清，未侵犯肾盂；镜下见多个囊腔，内衬立方上皮，囊壁见疏松纤维组织；免疫组化结果为：Desmin阳性、P53阳性、WT1阴性、Inhibin阴性、ER阴性(图 4)；输尿管切缘阴性。病理诊断考虑“左肾囊性肾瘤”。
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图 4 儿童囊性肾瘤手术标本和病理结果 Fig.4 Gross and histological details of kidney tumor A：完整切除左肾及肿瘤; B：标本剖面，肿瘤包膜完整，可见少量肾实质(箭头); C：HE染色病理切片(×100); D：ER阴性(D~H免疫组化染色，×400); E：Inhibin阴性(D~H免疫组化染色，×400); F：P53阳性(D~H免疫组化染色，×400); G：WT1阴性(D~H免疫组化染色，×400); H: Desmin阳性(D~H免疫组化染色，×400) |
患儿外周血DNA的基因组中发现DICER1基因有1个杂合突变：c.2801delC(exon17，NM_177438)，在患儿肿瘤组织DNA的基因组中发现DICER1基因有2个位点发生突变：c.5428G＞T(exon25，NM_177438，突变频率12%)和c.2801delC(exon17，NM_177438，突变频率49%)，见图 5。第5428号核苷酸由鸟嘌呤G变为胸腺嘧啶T(c.5428G＞T)的突变，导致氨基酸发生错义突变，第1810号氨基酸由天冬氨酸变为酪氨酸(p.D1810Y)，该突变位点位于chr14:95557639。第2801位胞嘧啶缺失(c.2801delC)的突变，导致氨基酸发生移码突变，第934位氨基酸由脯氨酸突变成谷氨酰胺，继续编码12位后终止(p.P934Qfs*14)，该突变位点位于chr14:95573947-95573948。
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图 5 儿童囊性肾瘤基因突变图谱 Fig.5 A germ-line DICER1 mutation (c.2801delC) and two somatic mutations (c.2801delC & c.5428G > T) were detected A: 外周血中c.2801delC突变的一代测序图; B: 外周血中c.5428位点未检测到突变; C: 肿瘤组织中c.2801delC突变的一代测序图; D: 肿瘤组织中c.5428G＞T突变的一代测序图; E: 肿瘤组织中c.2801delC突变的二代测序图; F：肿瘤组织中c.5428G＞T突变的二代测序图 |
患儿出院后泌尿外科定期复诊，一般情况良好，无明显自觉不适，术后6个月复查腹部B超及CT未发现明显肿瘤残留及复发。
四、文献分析根据检索策略，目前中文文献尚无儿童囊性肾瘤伴DICER1基因突变的病例报告。英文文献中，同时进行了外周血和肿瘤组织的基因检测、并且同时检测到胚系和体细胞突变的仅有6例报道(表 1)[6-11]。
| 表 1 同时检测到DICER1基因胚系和体细胞突变的pCN病例 Table 1 Cases of pCN with both germline and somatic mutations of DICER1 gene |
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DICER1基因位于14号染色体q32.13，编码一种名为Dicer酶的RNA内切酶，属于RNase Ⅲ家族，该酶主要作用于microRNA(miRNA)生物合成的最后一个环节，Dicer酶通过调节miRNA参与超过30%的蛋白编码基因的转录后基因表达[12]。经典的miRNA生物合成通路，由编码miRNA的基因首先转录出初级miRNA(pri-miRNA), pri-miRNA在细胞核中被Drosha酶加工成前体miRNA(pre-miRNA)，随后pre-miRNA被转运到细胞质中，由Dicer酶进一步加工成长度约22个核苷酸的成熟miRNA，该成熟miRNA的一条链参与合成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，与互补mRNA的靶点结合，从而调节基因表达、抑制mRNA降解[13]。在DICER1基因编码RNase IIIb结构域的外显子中发生的错义突变，被认为是肿瘤热点基因位点，包括p.E1705、p.D1709、p.G1809、p.D1810、p.E1813、p.D1713等。这些位点的突变会引起Dicer酶的RNase IIIb结构异常，从而干扰前体miRNA的经典加工过程，使得3p-miRNA相对过剩、5p-miRNA水平低下，最终影响miRNA的生物合成，从而引起miRNA功能失调，促使患者抑癌基因功能缺失或致癌基因功能增强，进一步诱发多种肿瘤的发生[14]。目前DICER1综合征相关肿瘤潜在的发生机制尚不清楚，有假说认为5p来源的肿瘤可抑制miRNA(如let-7家族的miRNA)的缺失，导致其靶癌基因表达上调[15]。
DICER1基因突变可通过常染色体显性遗传，在美国大约每10 600人中就有1人携带该突变基因[16]。但因为该基因外显率低，据估计5.3%的携带者在10岁前会发生肿瘤、19.3%的携带者在50岁前会发生肿瘤[17-18]。约70%的PPB和pCN可归因于致病性DICER1基因突变[19]。目前, 因DICER1基因胚系突变而导致机体易患各种良恶性肿瘤的遗传疾病统称为DICER1综合征，其在儿童中的主要临床表现包括PPB、pCN、肾间变性肉瘤、Wilms'肿瘤、子宫颈胚胎型横纹肌肉瘤、分化型甲状腺癌、松果体母细胞瘤、睫状体髓质上皮瘤等[20]。
儿童囊性肾瘤好发于2岁以内婴幼儿，男性多于女性，临床症状最常见的是可触及的腹部包块，其他包括腹痛、贫血、高血压、血尿、尿路感染等。pCN缺乏特异的血清学检测指标，常用的影像学检查包括B超、CT和MRI。B超表现为肾区包膜完整的囊性包块，其内被分隔成大小不等的多个囊腔，包块内无血流信号或低血流信号；CT可见分界清、包膜完整的肾内囊性包块，其内分隔的囊腔呈蜂窝样改变，增强扫描可见囊壁及分隔强化，包块周围可见残余肾脏组织；MRI有助于了解肿块形态，对肿块包膜、囊内分隔及囊腔出血的诊断敏感性高。仅通过影像学检查来区分pCN与其他肾脏囊性病变具有挑战性，尤其不易与囊性部分分化性肾母细胞瘤(cystic partially differentiated nephroblastoma, CPDN)区分，确诊仍需根据术后病理结果[21]。
pCN的治疗以手术为主，一般不建议术前或术后放疗、化疗[21]。囊性肿瘤行穿刺活检有很高的肿瘤溢出风险，且很难捕捉到肿瘤特异性部位，故一般不推荐术前穿刺活检[22]。pCN为良性病变，一般无淋巴结及远处转移，根据肿块的位置、大小以及对侧肾脏的情况，可以选择性行保留肾单位的手术。宋宏程等[23]认为当肿块为单侧病变、位于肾脏一极且直径不超过6 cm，或者肿块为双侧病变时，可行保留肾单位的肿块剜除术。本例肿块长径约10 cm，肿块位于肾脏中极，术前影像学检查不能排除CPDN，遂行左瘤肾切除术。
儿童囊性肾瘤复发率低，预后较好，目前认为DICER1相关pCN恶性转化的风险较低，也有文献报道pCN恶性转化为肾间变性肉瘤[7]。DICER1综合征与肿瘤易感有关，因此推荐pCN患儿进行相关基因检测，对存在DICER1基因突变(尤其是胚系突变)的患儿进行长期随访监测。DICER1综合征的随访监测指南建议8岁前每4~6个月进行一次胸部X线检测，8岁后每年1次，直至12岁；8岁开始行甲状腺超声检查，每3~5年1次；8岁开始每6~12个月进行1次盆腔超声检查，至少持续至40岁；对儿童囊性肾瘤和其他肾肿瘤的检查包括每6个月进行1次腹部超声检查至8岁，然后每年进行1次至12岁；从3岁开始，每年进行一次视力检测和扩大眼科检查，至少持续至10岁，以确定有无睫状体髓质上皮瘤[24]。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 文献检索为诸林峰、沈一丁，论文调查设计为诸林峰, 数据收集与分析诸林峰、沈一丁, 论文结果撰写为诸林峰, 论文讨论分析为诸林峰、傅君芬
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