雄激素不敏感综合征(androgen insensitivity syndrome, AIS)是由于雄激素受体(androgen receptor, AR)基因发生突变引起的X染色体相关的隐性遗传病，该病以靶组织对雄激素的抵抗为主要特征；AIS是最常见的46, XY性别发育异常(disorders of sex development, DSD)，发病率为1 : 100 000~90 000^[1]，可根据临床表现严重程度分为3类：完全性雄激素不敏感综合征(complete androgen insensitivity syndrome, CAIS)、部分性雄激素不敏感综合征(partial androgen insensitivity syndrome, PAIS)和轻度雄激素不敏感综合征(mild androgen insensitivity syndrome, MAIS)。

性别分配是AIS治疗的难点。虽然CAIS性别分配通常为女性，并得到2006年芝加哥DSD共识的推荐^[2]，但也不断出现患儿成年后对分配性别不满意的报道^[3]。而PAIS无论性别分配为男性还是女性，性别分配结果不满意者均占比较高，部分患儿甚至因性别焦虑(gender disphoria，GD)而要求重新进行性别分配^[4]。因此，筛选出成年后性别认同和青春期后外生殖器发育程度的预测因素对合理化性别分配具有重要意义。浙江大学医学院附属儿童医院近3年共对440例疑似DSD患儿进行分子生物学诊断，发现46, XX DSD 63例，46, XY DSD 342例, 性染色体DSD 35例，其中21例存在AR基因突变，我们在分子诊断结果的基础上结合外生殖器雄性化评分(external masculinisation score, EMS)^[5]、性心理评估结果、外生殖器对雄激素反应程度等作为预测因素对AIS患儿进行性别分配，现总结报告如下。

材料与方法 一、研究对象

21例AR基因突变AIS患儿年龄3个月到13岁5个月，中位数为49.7个月。外生殖器均表现为不同程度的雄性化不全，其中8例外生殖器表型完全女性化，就诊原因包括：双侧腹股沟斜疝(3例)、腹股沟肿物(3例)、体重快速增加(1例)、青春期无月经(1例)；10例表型为外生殖器模糊，包括轻度阴蒂肥大(6例)、Ⅲ度尿道下裂(4例)；3例外生殖器表型为小阴茎。初诊性别女14例，男7例。

二、研究方法

在详细的病史(包括家族史)询问及体格检查同时，进行以下评估：

1.外生殖器评估：采用EMS评分系统对雄性化程度进行分级(表 1)^[5]，采用Prader评分系统对外生殖器表型进行分级^[6]。Prader 0级特征为正常女性外观(计0分)；PraderⅠ级特征为轻度阴蒂肥大(计1分)；PraderⅡ级特征为阴蒂肥大，但可见尿道和阴道分别开口(计2分)；PraderⅢ级特征为阴蒂肥大伴单一尿生殖道开口(计3分)；PraderⅣ级特征为阴蒂肥大及尿道下裂(计4分)；PraderⅤ级特征为“正常”(仍为小阴茎)男性外观(计5分)。

2.影像学和内镜检查：通过超声和腹腔镜检查评估性腺的位置和发育情况。当性腺出现结构、形态异常或不能明确为睾丸或卵巢时，取性腺组织进行组织病理学检查，同时了解苗勒氏管残余(包括子宫、输卵管、阴道及输精管、附睾的发育情况)；通过膀胱镜检查阴道是否存在、是否高位与尿道汇合等情况。

3.实验室检查：测定血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、睾酮(testosterone, T)、双氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT)、抗苗勒氏管激素(anti-mullerian's hormone, AMH)等激素水平，并分析HCG激发后血清T及DHT水平的变化情况。

4.性心理评估：5岁以下患儿的性别角色行为采用学龄前活动量表^[7](pre-school activities inventory, PSAI)进行评估，该量表包括24项内容，其中有关玩具的条目7项、有关活动的条目11项、有关性格特征的条目6项，男性化和女性化内容各占50%，每个条目的评级分为“没有、很少、有时有、常有和很常见”5个等级，得分分别对应1~5分。量表完成后，12项女性化条目得分之和为女性化积分，12项男性化条目得分之和为男性化积分，最后按公式计算量表总得分，总得分=48.25+1.1×(男性化积分-女性化积分)。5岁以上采用儿童性别角色量表^[8](children's sex role inventory, CSRI)进行评估，该量表共包括60个条目，男性化、女性化、中性化相关条目各20条，具有良好的可靠性和正确性，患儿根据自身真实情况作出独立回答，答案选项分为“不符合、部分符合、大部分符合和非常符合”4个等级，得分分别为1~4分。男性化项目得分相加除以条目数得到的平均分为男性化得分, 女性化项目得分相加除以条目数得到的平均分为女性化得分，二者的差值即为CSRI得分。结合心理科沙盘心理测试和艾森克个性问卷调查(eysenck personality questionaire, EPQ)分析性别优势，结果评估：PSAI＞51.10或CSRI＞0为男性优势，PSAI≤51.10或CSRI≤0女性优势。

5.外生殖器对雄激素的治疗反应：采用阴茎背侧根部外用睾酮霜、双氢睾酮霜或肌肉注射HCG(500~1 000 IU，每周2次)的方法进行治疗，治疗时间为4周，测量使用前后阴茎牵伸长度，根据阴茎增长程度了解雄激素治疗反应是否有效。

6.基因芯片：采用第二代测序法测定性别发育相关基因。经患儿家长知情同意，用乙二胺四乙酸抗凝管抽取患儿及其父母外周静脉血各2 mL，使用血液基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA。使用标准文库构建试剂盒进行基因组文库构建，采用目标序列捕获探针对163个已知的遗传性DSD候选基因进行捕获，借助NextSeq500测序仪对捕获的163个基因相应的外显子区进行高通量测序。利用BWA软件将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列(hg19)上。利用GATK软件分析得出单核苷酸变异和插入缺失突变的相关信息，然后通过ANNOVAR软件对所有的SNP和INDEL进行注释。筛选正常人数据库中突变频率＜0.05的位点，正常人数据库包括千人基因组计划、Exome Variant Server和EXAC。错义突变使用REVEL、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和GERP等软件进行致病性和保守性预测，剪切位点的改变用SPIDEX等软件分析其致病性。结合疾病遗传模式和患儿临床表征进行综合分析，筛选出可疑候选变异。利用PCR和Sanger测序验证经分析筛选后得到的候选变异位点，同时利用Primer 3.0在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计PCR引物。PCR扩增产物使用3130XL测序仪进行毛细管电泳测序并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上进行分析，后在家系成员中进行共分离验证。

诊断明确后，由本院MDT(内分泌科、泌尿外科、少儿妇科、心理科、遗传代谢科、肿瘤科、影像学等专家组成)综合分析病因、性心理评估结果、EMS评分、性腺发育情况、性腺肿瘤风险、潜在生育机会、社会文化环境因素等，与患儿父母及(或)本人进行充分沟通后，作出合适的性别分配并制定相应的治疗方案。

三、统计学分析

采用SPSS 20.0进行统计学分析。由于本研究中Prader得分和EMS得分基本不服从正态分布，因此得分采用中位数进行描述，两组间比较采用独立样本秩和检验。雄激素治疗结局、性心理评估定性的结果与性别分配间的关联性分析采用Fisher精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结  果

21例EMS得分区间为1~9分，中位值为2分。7例EMS得分≥5分，其余14例得分为1~3分。AR基因突变情况：①突变位点：8例(38%)位于1号外显子，6例(28.6%)位于4号外显子，4例位于5号外显子(19.1%)，2例(9.5%)位于8号外显子，1例(4.8%)位于7号外显子。②突变类型：2例为缺失突变，1例为缺失移码突变，1例移码突变，其他17例为错义突变。2例缺失突变位置相同，缺失位置目前还未见报道，但已知位于染色体chrX-66766356-667663681，1号外显子的1369_1380核苷酸缺失，导致氨基酸457_460缺失。③基因突变类型和位点与外生殖器表型相关性：8例CAIS除1例位于1号外显子外，余7例位于雄激素结合域(即4~8号外显子区)；而13例PAIS有7例均位于1号外显子，其中3例表现为小阴茎。

激素水平：基础睾酮水平明显升高者为3例小青春期(小于6月龄，睾酮范围1.24~7.62 nmmol/dL，中位值为5.72 nmmol/dL)和3例青春期(睾酮范围6.78~15nmmol/dL，中位值为13.64 nmmol/dL)儿童，15例行HCG激发试验，睾酮均明显升高(睾酮范围1.58~19.7 nmmol/dL，中位值为3.58 nmmol/dL，较基础睾酮水平升高2~19倍)，提示睾丸间质细胞有良好的睾酮分泌功能。2例CAIS青春期患儿FSH和LH水平出现异常升高，余19例无明显异常。21例DHT和AMH水平均无明显异常。

雄激素使用后阴茎增长情况：8例外生殖器完全女性化患儿中3例曾使用雄激素，阴茎未见增大；11例外生殖器模糊或小阴茎患儿采用雄激素治疗后，除1例阴茎增大不明显外，余10例阴茎出现较为明显的增长(增长41.3% ~86.3%，中位值为55.8%)，提示雄激素治疗效果理想。

性心理量表评估：6例超过5岁儿童采用CSRI调查结合沙盘游戏进行评估，12例小于5岁以下的儿童则采用PSAI问卷进行评估。外生殖器完全女性的7例评估结果均表现为女性优势，而11例Prader评分为1~5分的患儿中仅有1例表现为女性优势，提示CAIS患儿以女性优势为主(100%)，而PAIS则大多存在男性优势(90.9%)。

21例患儿中8例诊断为CAIS，Prader评分为0分，EMS评分为1~2分，性心理量表评估结果均为女性优势，且外生殖器对雄激素治疗无反应，性别分配均为女性。10例Prader评分为1~3分的PAIS患儿EMS评分为2~9分，性心理量表评估除1例为女性优势外，其他均为男性优势，接受雄激素治疗后阴茎增长明显，性别分配均为男性。3例小阴茎患儿性心理量表评估结果均表现为男性优势，雄激素治疗后阴茎明显增长，性别分配均为男性。

性别分配为女性者Prader评分均为0分，性别分配为男性者中位Prader评分为3分(范围1~5分)，两组间Prader评分差异有统计学意义(Z=3.919，P＜0.01)。性别分配为女性者中位EMS评分为2分(范围1~2分)，性别分配为男性者中位EMS评分为6分(范围2~9分)，两组间EMS评分差异有统计学意义(Z=3.257，P＜0.01)。雄激素治疗结局、性心理评估定性的结果与性别分配间均存在关联(P＜0.05)。各预测因素与性别分配结果间的关联性分析见表 3。

讨  论

AIS性别分配的时机存在争议^[9]。通常认为性别分配应在患儿心理初步成熟后由其自行决定，但模糊的外生殖器、长期不明确的社会性别会导致患儿出现心理障碍，其父母也不知应采用何种方式与孩子进行互动；有研究认为外生殖器的模糊程度和母亲焦虑程度密切相关^[10]，而母亲的焦虑又会间接影响儿童的心理社会功能和自身性别认同的后续发展^[11]。一项针对成年AIS患儿性别认同的研究发现，抚养性别可能是影响PAIS患儿成年后性别认同的重要因素^[12]。因此我们认为，AIS一旦明确诊断应尽早进行性别分配。本组21例患儿，确诊后均进行明确的性别分配，获得了患儿及其家长的认可。

AIS性别分配的目标是尽量使得分配的性别和未来的性别认同一致，帮助患儿较好地融入社会，并保证其日后的生活质量。由于残留的AR基因行使其生物学功能，雄激素对PAIS群体的男性化作用往往高于正常女性，但低于正常男性^[12]，这导致PAIS患儿的性别认同存在很大的可变性^[13]。因此，PAIS的性别分配非常困难，迄今为止临床上仍没有标准的PAIS性别分配推荐方案，临床医师大多根据外生殖器雄性化不全的程度来进行性别分配，而对未来性别认同和青春期后外生殖器发育程度的预测仍不够精确，导致较高的性别分配不满意率^[3]。Mazur报道了99例PAIS患儿中高达10%患儿成年后要求性别转换^[14]。因此，准确判断成年后性别认同和外生殖器发育程度是性别分配的关键。

AR基因突变是引起AIS的分子生物学因素之一，但只有28% ~50%的PAIS可以检测到AR基因突变^{[15, 16]}。目前研究发现，AR基因正常但与其相关的辅助活化因子、下游通路或邻近的非编码区的分子发生异常突变也可引起AIS^[17]。Lucas-Herald等^[17]对青春期后AIS患儿进行研究发现，存在AR基因突变的男性青春期后临床结局比无AR基因突变者差，所有出现AR基因突变的患儿青春期后均出现乳房发育，无AR基因突变者这一比例仅9%。此外，AR基因突变与尿道下裂手术结果之间也存在明确的相关性，存在AR基因突变者需要接受的手术次数更多。O'Hara等^[18]研究发现雄激素需要通过AR基因在精子发生过程中发挥作用，尤其是在维持精原细胞数量、血睾屏障、精子细胞数量、精细胞的粘附及精子形成等方面，AR基因突变患儿通常存在无精症或少精症，生育机率更低。本组21例患儿，除3例因小阴茎就诊外，其他18例(85.7%)均存在重度外生殖器雄性化不全，其中8例表现为完全女性化，6例表现为外生殖器模糊，4例表现为重度尿道下裂。虽然在接受雄激素治疗后阴茎有不同程度的增长，但仍低于其他类型的46, XY DSD(如5a还原酶缺乏症等)。我们的研究结果也认为，存在AR基因突变者青春期后结局可能不如其他类型46, XY DSD，因此AR基因不仅为AIS的性别分配提供了分子诊断依据，而且可以作为性别分配时远期预后的预测指标。

Ngee等^[19]对存在AR基因突变的PAIS患儿进行出生时EMS与青春期结局关系的研究，发现EMS < 5分的群体中只有67%经历了自发性青春期，17%外生殖器达到Tanner 4~5期；而EMS≥5分的群体这两项指标分别为100%和85%左右，因此可以认为EMS是预测AIS患儿自发性青春期和成年后外生殖器发育简单、有效的指标。本组PAIS患儿7例EMS≥5分，其中3例接受外用雄激素治疗后阴茎均有明显增大，提示青春期后外生殖器可能会有较好的发育。而EMS < 5分的6例患儿接受雄激素治疗后增长比例低于EMS≥5分的患儿。

外生殖器表型及其对雄激素的反应能力是决定性别分配的重要因素^[20]。大剂量的睾酮或双氢睾酮可以帮助PAIS患儿增加阴茎的长度，并改善男性第二性征，使用6个月后可以观察到非常明显的雄性化改善^[21]，因此近几十年来，越来越多的PAIS患儿性别分配为男性^[22]。本组11例PAIS患儿接受雄激素治疗后仅1例患儿外生殖器没有明显增大，但青春期后发育情况还需要进一步随访，这也提示对PAIS患儿进行男性性别分配时，应考虑外生殖器对雄激素反应的程度。此外，10例重度雄性化不全的PAIS患儿性心理量表评估结果均为男性优势，提示成年后为男性性别认同可能较大；虽然存在AR基因突变，青春期后外生殖器可能发育不佳，但采用雄激素治疗后阴茎也出现明显增大。虽然PAIS患儿通常没有生育能力，但也有研究发现，通过长期大剂量睾酮治疗，改善了精子数量和活力，通过卵细胞内精子注射技术仍可获得生育能力^[23]，因此男性性别分配保留了生育可能性。虽然保留睾丸GCT发生率可达15%^[24]，但通过定期体格检查、超声和MRI检查可以早期发现性腺肿瘤改变，也可通过检测血液定向microRNA肿瘤标记早期发现原位生殖细胞肿瘤^[25]。

虽然有文献报道女性性别分配的小阴茎患儿成年后也可获得女性性别认同，没有明显的性别焦虑^[14]，但我们认为男性性别分配可能更为合适(不需要手术干预)。Becker等^[26]曾选择外用双氢睾酮霜对青春期前和青春期PAIS小阴茎者进行治疗，发现治疗后阴茎可增大40% ~63%。虽然成年后可能出现性腺机能减退，但一般不需要通过雄激素治疗就可出现自发性青春期^[14]。本组有3例小阴茎患儿虽然存在AR基因突变，但EMS评分为8~9分，雄激素治疗后阴茎明显增长，性心理评估为男性优势，因此性别分配均为男性。

CAIS患儿在胎儿期，大脑缺乏雄激素印记，性别认同通常为女性，扮演女性性别角色，但性趋向多为男性^[27]；外生殖器和女性性别一致，成年后通过适当的阴道扩张，90%以上的病例可获得阴道功能^[1]，很少需要外科手术。而且CAIS性腺恶变机率非常低，青春期后只有1.5%，且发生恶变的年龄均大于20岁^[28]，青春期前恶性肿瘤更罕见，到目前为止文献报道仅1例，为一17月龄患儿腹腔内卵黄囊瘤^[29]；作女性性别分配的患儿可以保留睾丸，无需激素替代治疗即可出现自发性青春期。因此，CAIS患儿通常被推荐女性性别分配。最近的一项研究发现，与正常女性相比，女性性别的CAIS患儿成年后自信心、性唤醒能力、性欲望及性快感等水平均较低^{[30, 31]}；但主流观点均认为女性性别分配的CAIS患儿在成年后可获得女性性别认同^[27]。本组8例CAIS患儿性心理评估结果均为女性优势，其中3例年龄12岁以上的青春期CAIS患儿本人表示明确女性性别认同，不存在性别不安的情况；8例患儿均存在AR基因突变，EMS评分低于2分，其中3例青春期和1例3月龄患儿基础睾酮水平很高(6.78~15 nmmol/dL)，另3例基础睾酮水平较低者予以雄激素治疗，阴茎均无明显增大，提示按男性分配外生殖器发育不佳，因此本组CAIS患儿性别分配均为女性。2例青春期患儿在自己和家长的要求下接受了性腺切除术，病理结果提示“生精小管发育不良、纤维组织增生、间质细胞增生”，提示生精障碍，进一步支持AR基因突变患儿青春期后结果不良的观点。因此，综合CAIS患儿未来的性别认同、第二性征发育和激素替代、性腺肿瘤风险和生育能力等，将其性别分配为女性是适当的。

综上所述，我们认为通过分析AR基因突变情况、EMS评分、性心理评估和外生殖器雄激素治疗反应等指标可对AIS未来性别认同、外生殖器发育程度等青春期后临床结局进行较为合理的预测，在充分考虑社会文化因素、患儿及其父母主观层面认知的情况下，由MDT进行性别分配是目前AIS性别分配较为合适的方法。但考虑到本组病例随访时间较短，因此更加严谨的结果还需要通过长期追踪，到青春发育期后(或成年后)才能确定。