2018, Vol. 17
2. 天津市儿童医院普外科(天津市，300134)；3.天津市儿童医院病理科(天津市，300134);
3. Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
2. Department of Pediatrics, Tianjin Children's Hospital, Tianjin Institute of Pediatrics, Tianjin 300134, China;
3. Department of Pathology, Tianjin Children's Hospital, Tianjin 300134, China
胆道闭锁(biliary atresia, BA)是一种以肝内外胆管进行性炎症、纤维性梗阻、肝内胆汁淤积及进行性肝纤维化为主要特征的婴幼儿肝胆疾病[1]。有研究显示自体肝20年生存率不足20%，30年生存率仅10%[2, 3]。Obayashi等[4]发现胆道闭锁自体肝生存时间与胆管反应程度有关，而胆管反应(ductular reaction, DR)的主要原理是肝干细胞或肝原始祖细胞分化为CK7阳性细胞谱系后，CK7可作为肝干细胞分化后中间肝细胞和胆管上皮细胞的标记抗体[5-6]。与胆管反应相关的生物标志物中，CK19的表达能够反应胆管细胞的增生情况，CD56和EpCAM作为不成熟胆管上皮细胞的标志物[7-8]，同样可用于胆管反应的临床监测。本研究旨在探讨自体肝生存时间与Kasai手术时肝活检组织中胆管反应的关系，分析胆管增生细胞的来源及性质，为BA患儿的预后评估提供病理学证据。
材料与方法 一、标本来源与分组以2012年1月至2012年12月经天津市儿童医院确诊为胆道闭锁并行Kasai手术的患儿为研究对象，主刀医生为同一高年资主任医师，按照Kasai手术后自体肝生存时间将BA患儿分为两组：自体肝生存时间超过5年，且长期随访未出现消化道出血、严重腹水、反复胆管炎、肝功能失代偿等的10例BA患儿为预后良好组(BA-A组)，其中男4例，女6例，手术时日龄为(61.00±3.59)d。1年内死亡或行肝移植的10例为预后不良组(BA-B组)，其中男3例，女7例，手术时日龄为(61.90±2.42)d，两组手术时日龄无统计学差异(P>0.05)。同期收集本院收治的胆总管囊肿患儿10例(CC组)，其中男6例，女4例，手术时月龄为(36.60±11.8)m；胆汁淤积症患儿10例(CS组)，其中男7例，女3例，手术时日龄为(61.00±3.23)d；另选取非肝胆疾病且年龄 < 24个月尸检病例5例，其中男3例，女2例，患儿死亡时月龄为(12.20±6.42)个月。
本研究经天津市儿童医院伦理委员会讨论通过。
二、主要试剂与仪器兔抗人CK7、CK19、CD56、EpCAM单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二抗为辣根酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG聚合物与DAB(3, 3'-diaminobenzidine，3, 3-二氨基联苯胺)显色试剂盒，均购自北京博奥生物技术有限公司；ImagePro Plus 6.0自动定量分析系统购自美国Media Cybernetics公司。
三、实验方法1.肝组织标本处理：术中取BA、CC、CS患儿肝右叶前缘组织，经10%福尔马林溶液固定，8~24 h后经石蜡包埋储存，尸检肝组织来源于本院病理科已包埋的蜡块，所有标本处理过程均于同一实验条件下完成。
2. HE染色：病理切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗，浸染苏木素5 min，经酸化伊红乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脱水，透明剂浸泡至透明，中性树胶封片等一系列操作。在光学显微镜下观察肝组织细胞形态、胆管增生程度、肝纤维化程度、有无胆栓、炎症细胞浸润程度等。
3.免疫组化染色：病理切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复15 min，冷却至室温，PBS缓冲液冲洗3次，于3% H2O2 37℃中孵育10 min，再用PBS冲洗3次，滴加一抗(CK7、CK19、CD56、EpCAM)，于冰箱4℃过夜，次日取出置于室温30 min，PBS冲洗3次，加二抗于37℃下孵育30 min，PBS冲洗3次，经DAB显色5~10 min，镜下观察染色情况，充分水洗，苏木素液染核，脱水、透明、中性树胶封片。
四、病理学评分指标1.肝纤维化程度分级：采用METAVIR纤维化分级(0~4)标准。F0：无纤维化；F1：肝汇管区轻度纤维化；F2：邻近汇管区轻度桥接纤维化；F3：伸向邻近汇管区重度桥接纤维化；F4：肝硬化、假小叶形成[9]。
2.胆管增生程度分级：随机选取5个不同汇管区的视野，计数胆管数量，取平均值为最终结果。增生程度共分为4级，平均每个视野小于5个增生胆管判定为0级(无增生)；平均每个视野5~9个增生胆管判定为1级(轻度增生)；平均每个视野≥10个增生胆管判定为2级(中度增生)；平均每个视野增生胆管＞10个的基础上合并增生胆管形态扭曲异常、细小等表现，判定为3级(重度增生)[10]。
3.胆栓分级：1级：汇管区无胆栓；2级：仅部分汇管区的部分胆管存在胆栓；3级：所有汇管区的部分胆管存在胆栓；4级：几乎所有汇管区的全部小胆管均存在胆栓[11]。
4.炎症细胞浸润程度分级：观察汇管区细胞核总数(T)及炎症细胞数目(N)，并据其计算分级炎症浸润程度(I=N/T×100%)。炎症细胞浸润程度：1级为Ⅰ < 25%；2级为25%≤Ⅰ < 50%；3级为50%≤Ⅰ < 75%；4级为Ⅰ≥75%。
说明：肝纤维化程度、胆管增生程度、胆栓及炎症细胞浸润程度的分级计分规则为：1级计1分，2级计2分，3级计3分，4级计4分。
五、免疫组化结果1.定性分析：根据染色强度分为阴性(无棕黄色)、弱阳性(淡棕黄色)、阳性(棕黄色)、强阳性(棕褐色)。
2.半定量分析：根据肝组织切片内阳性细胞总光密度值/阳性细胞所占面积求得平均光密度值(AOD)。每张切片内取任意5个视野，用同一计算机成像系统留取相同倍数的镜下图片，采用IPP 6.0计算CK7、CK19、CD56、EpCAM蛋白的AOD。
六、统计学方法采用SPSS 22.0进行统计分析，正态分布的计量资料用(x ±s)表示，两组间计量资料比较依据数据是否服从正态分布分别采用t检验或秩和检验，多组间计量资料比较采用方差分析(方差齐采用Bonferroni法，方差不齐采用Tamhane法)；率的比较采用R×C列联表资料的χ2检验，组间两两比较采用Bonferroni法进行显著性水平校正；非正态分布的计量资料用中位数及四分位数[M(P25~P75)]表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间多重比较采用Bonferroni法进行显著性水平校正。以P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果 一、HE染色胆道闭锁预后良好组与预后不良组HE染色镜下共同病理特点包括：汇管区增宽，胆管增生，纤维组织增生、桥接纤维化现象普遍，部分患儿可见假小叶形成，伴炎症细胞浸润，偶可见胆栓和肝细胞巨细胞变(图 1A)。胆总管囊肿镜下肝小叶结构存在，个别汇管区稍增宽，胆管及纤维组织增生不明显，伴少量炎症细胞浸润(图 1B)。胆汁淤积症镜下肝小叶结构存在，毛细胆管可见胆栓，个别汇管区稍增宽，胆管及纤维组织增生不明显，伴少量炎症细胞浸润(图 1C)。尸检镜下肝小叶结构存在，伴少量炎症细胞浸润(图 1D)。
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| 图 1 A.胆道闭锁HE染色，箭头所指为胆栓(×100)；B.胆总管囊肿HE染色(×100)；C.胆汁淤积症HE染色，箭头所指为胆栓(×100)；D.尸检HE染色(×100) Fig. 1 A.BA for HE staining, arrow indicated biliary plug (×100); B.Choledochal cyst for HE staining (×100); C.Cholestasis for HE staining, arrow indicated biliary plug (×100); D.Autopsy for HE staining (×100) | |
胆道闭锁(BA)、胆总管囊肿(CC)、胆汁淤积症(CS)及尸检对照组肝纤维化程度、胆管增生、胆栓、汇管区炎症细胞浸润程度的评分结果见表 1。4组患儿肝纤维化、胆管增生及胆栓评分比较，差异有统计学意义(H=24.208，P < 0.05；H=39.779，P < 0.05；H=23.119，P < 0.05)，除CS组胆栓分级与BA组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余组间两两比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)；4组患儿汇管区炎症细胞浸润程度评分比较，差异均无统计学意义(H=5.812，P>0.05)。
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表 1 BA、CC、CS及尸检组肝脏病理学评分结果M(P25~P75) Table 1 Hepatic pathological scores of BA, CC, CS and autopsy groups M(P25~P75) |
胆道闭锁预后良好组(BA-A)与预后不良组(BA-B)肝纤维化程度、胆管增生、胆栓、汇管区炎症细胞浸润程度的评分结果对比见表 2。2组患儿肝纤维化、胆管增生、胆栓及汇管区炎症细胞浸润程度的评分差异均无统计学意义(P>0.05)。
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表 2 不同预后BA患儿的肝脏病理学评分结果M(P25~P75) Table 2 Hepatic pathological score in BA children with different prognoses M(P25~P75) |
CK7蛋白：BA组和CC组汇管区胆管上皮细胞胞质中均呈强阳性表达，但BA组表达强度更高；CS组和尸检组汇管区胆管上皮细胞胞质中呈弱阳性表达(图 2A、2E、2I、2M)。
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| 图 2 4组免疫组化染色共位图(×100)图A至图D分别为胆道闭锁患儿CK7、CK19、CD56、EpCAM四种抗体的免疫组化结果；图E至图H分别为胆总管囊肿患儿CK7、CK19、CD56、EpCAM四种抗体的免疫组化结果；图I至图L分别为胆汁淤积症患儿CK7、CK19、CD56、EpCAM四种抗体的免疫组化结果；图M至图P分别为尸检患儿CK7、CK19、CD56、EpCAM四种抗体的免疫组化结果 Fig. 2 Immunohistochemical staining in all groups (×100) A-D.were immunohistochemical results of CK7, CK19, CD56 and EpCAM antibodies in BA children; E-H the immunohistochemical results of CK7, CK19, CD56 and EpCAM antibodies in choledochocele children respectively; I-L immunohistochemical results of CK7, CK19, CD56 and EpCAM antibodies in cholestatic children; M-P immunohistochemical results of CK7, CK19, CD56 and EpCAM antibodies in children with autopsy | |
CK19蛋白：BA、CC、CS和尸检组汇管区胆管上皮细胞胞质中均呈强阳性表达，且表达强度较CK7更高(图 2B、2F、2J、2N)。
CD56蛋白：BA组中75%(15/20)的患儿汇管区胆管上皮细胞胞质中呈弱阳性表达，预后良好组与预后不良组发生CD56表达的患儿比例无统计学差异(7/10 vs.8/10，P>0.05)；CC组、CS组和尸检组偶见汇管区胆管上皮细胞中弱阳性表达(图 2C、2G、2K、2O)。
EpCAM蛋白：BA组、CC组、CS组和尸检组汇管区胆管上皮细胞胞质中均呈阳性表达，但BA组表达更显著(图 2D、2H、2L、2P)。
四、免疫组化半定量结果CK7、CK19、CD56和EpCAM在BA、CC、CS及尸检对照组肝组织中表达量比较，差异有统计学意义(F=111.184，P < 0.05；F=1064.972，P < 0.05；F=79.054，P < 0.05；F=53.858，P < 0.05)，见表 3。BA预后良好组CK7、CD56、EpCAM表达量显著低于BA预后不良组，差异有统计学意义(t=12.686，P < 0.05；t=9.517，P < 0.05；t=5.232，P < 0.05)，但CK19蛋白表达量两组间差异无统计学意义(t=2.115，P>0.05)，详见表 4。
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表 3 四组患儿肝组织中CK7、CK19、CD56和EpCAM蛋白表达结果(x±s) Table 3 Comparing the expression levels of CK7, CK19, CD56 and EpCAM in liver tissues of four groups(x±s) |
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表 4 不同预后BA患儿肝组织中CK7、CK19、CD56和EpCAM蛋白表达结果(x±s) Table 4 The expressions of CK7, CK19, CD56 and EpCAM protein in liver tissues of BA children with different prognoses(x±s) |
影响Kasai手术后自体肝生存时间的因素较多，主要包括Kasai手术日龄、BA分型、是否伴发先天性畸形及行Kasai手术时肝脏病理特征(肝纤维化程度、胆管反应)等[12-17]。有研究显示BA患儿肝组织病理学评分可较为全面地评价BA患儿Kasai手术时肝脏受损严重程度。胆管反应指肝干细胞或肝原始祖细胞分化为CK7阳性细胞谱系，最终形成不成熟的微胆管[5, 16]，包括胆管增生、原始肝细胞的激活和中间肝胆细胞的出现等[20]。而BA胆管反应时伴有大量胆管细胞增生，增生胆管细胞以不成熟胆管上皮细胞为主，不成熟胆管上皮细胞短时间内的迅速增生可能影响自体肝生存[7]。但增生胆管细胞的性质和来源仍不清楚，因此应进一步明确自体肝生存与Kasai手术时肝活检组织中胆管反应的关系。
一、自体肝生存与肝病理学评分的关系本研究发现BA组、CC组、CS组及尸检组患儿肝纤维化、胆管增生及胆栓的评分差异均有统计学意义，其中BA组患儿肝纤维化程度重，胆管增生明显，且多伴胆栓。4组患儿肝组织病理学评分结果证明BA组患儿病理学评分较高，这提示病理学评分可作为BA与其他梗阻性黄疸患儿的鉴别诊断方法。
患儿在接受Kasai手术时，肝纤维化程度是影响BA术后自体肝生存时间的一个重要因素，但本研究预后良好组与预后不良组肝纤维化程度比较，差异无统计学意义。Obayashi等[4]认为BDP(汇管区胆管数量/汇管区测量面积)比值可作为胆道闭锁Kasai手术后自体肝生存时间的预测指标，该值的增高提示胆管反应时胆管数量显著增加，由此推测胆管增生可能与自体肝生存时间有关。但本研究预后良好组与预后不良组BA患儿的胆管增生分级无明显差异，可能是因为本研究中预后良好组与预后不良组BA患儿接受手术时日龄均在60 d左右，胆管增生程度均较轻；免疫组化CK19染色AOD值两组无差异，说明本研究中预后良好组与预后不良组的胆管增生情况基本无差异。
二、自体肝生存与胆管反应相关蛋白表达的关系角蛋白(cytokeratins, CK)是中间丝基因家族编码的一组复合产物，可分为酸性和中—碱性亚族。其中CK7属于中—碱性亚族，CK19属于酸性亚族。CK7可作为肝干细胞分化后中间肝细胞和胆管上皮细胞的标记抗体[6]；CK19则是胆管上皮细胞的经典标志物，能够直接反应胆管细胞的增生情况。CD56是神经细胞粘附分子的一种同型异构体，EpCAM是一种跨膜糖蛋白，有研究显示二者均可作为不成熟胆管上皮细胞的标志物[7-8]。据报道BA患儿肝移植时肝组织中CK7的表达量高于Kasai手术时，说明BA患儿病情较重时胆管反应更显著[21]。本研究中，BA患儿CK7蛋白表达量高于其他梗阻性疾病组和尸检组，预后不良组CK7蛋白表达量高于预后良好组。说明肝活检组织中CK7蛋白表达情况或许可作为自体肝生存时间的一个预测指标。本研究中CK19作为胆管上皮细胞的经典标志物，在所有胆管细胞中均呈强阳性表达。CK19蛋白在BA组的表达量明显高于其他各组，但预后良好组与预后不良组之间表达量无统计学差异，说明CK19可作为胆管细胞的标记抗体，反应胆管增生情况，但与自体肝生存时间的相关性可能不大。
通常情况下，正常成熟的胆管上皮细胞不表达CD56，而在某些引起胆管反应的疾病中，新生的胆管上皮细胞可表达CD56[22]。有研究显示，胆管上皮细胞越成熟，CD56的表达量越低[7]。CD56作为不成熟的胆管上皮细胞标志物，多表达于BA患儿肝组织紊乱增生的胆管上皮细胞中，且BA预后不良组表达量明显高于预后良好组，说明CD56的表达也可能与自体肝生存时间相关。
EpCAM在肝脏发育过程中，也是肝干细胞最早表达的标志物之一，在胚胎发育第8周即可见大量EpCAM阳性的肝干细胞[23]。EpCAM在肝干细胞分化过程中呈动态表达：分化为不成熟肝细胞时可出现EpCAM的表达；分化为成熟肝细胞时，则完全不表达EpCAM[24]。慕永平等[25]把EpCAM作为肝祖细胞的标志物，认为肝祖细胞参与了胆管反应的病理过程，是增殖胆管细胞的主要来源。本研究EpCAM蛋白在BA组的表达量显著高于其他3组，且BA预后不良组的表达量显著高于预后良好组。说明Kasai手术肝活检胆管反应EpCAM的表达也可能与自体肝生存相关。但EpCAM表达量明显高于CD56，这可能是因为CD56仅在胆管反应初期表达，随着胆管上皮细胞的成熟，表达量下降，而EpCAM蛋白表达于所有成熟之前的胆管上皮细胞，故表达量更高。
综上所述，肝组织病理学评分、肝纤维化程度、胆管增生程度等可作为BA与其他黄疸患儿的鉴别诊断依据。BA自体肝生存时间也可能与Kasai手术时肝组织胆管反应相关，但受样本选取的影响，本研究尚未发现自体肝生存与胆管增生的相关性，后期可考虑补充样本作进一步验证。
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