胆道闭锁是新生儿胆汁淤积的常见病因，据国内统计，单中心手术患儿2年自体肝生存率约为56.1%；而在我国台湾地区和英国，胆道闭锁自体肝生存率在80%以上^[1]。因此，如何准确识别胆道闭锁在我国仍有进一步研究的空间^[1]。

PIVKA-Ⅱ(Proteins Induced by Vitamin K Absence or Antagonism)是广泛分布于人体内的一种异常的凝血酶原，与机体凝血功能变化有关^[2-3]。有文献报道PIVKA-Ⅱ水平对于胆道闭锁患儿颅内出血有一定的诊断意义^[4-6]。另外，在原发性肝细胞肝癌患儿中，PIVKA-Ⅱ的诊断价值甚至高于AFP，联用AFP及PIVKA-Ⅱ可提高肝癌筛检的敏感性及特异性^[7-10]。目前，PIVKA-Ⅱ在胆道闭锁诊治中的应用研究较少。由于胆道闭锁患儿凝血功能、肝功能多存在异常，故推测其PIVKA-Ⅱ水平可能发生变化。因此，本研究将针对胆道闭锁患儿术前PIVKA-Ⅱ水平进行检测，并分析PIVKA-Ⅱ与胆道闭锁患儿肝功能指标及凝血功能的相关性，初步探索PIVKA-Ⅱ在胆道闭锁中的诊断价值。

材料与方法 一、研究对象

以本院2016年7月至2017年3月因梗阻性黄疸入院，术中诊断为胆道闭锁的患儿为研究对象。并选取排除胆道闭锁的胆汁淤积症患儿及同年龄段行臂丛神经损伤修复手术且肝功能正常的患儿作为对照。

胆道闭锁病例纳入标准：①在本院行胆道探查、胆道造影术，术中胆道造影证实为胆道闭锁者；②未合并其他系统畸形者。胆汁淤积病例纳入标准：①因梗阻性黄疸入院者；②术中胆道造影通畅，排除胆道闭锁的胆汁淤积者；③无其他系统畸形者。对照组儿童纳入标准：①年龄 < 4个月臂丛神经损伤者；②术前肝肾和凝血功能正常者；③无肝炎等传染病家族史者；④无其他系统畸形者。

排除标准：①胆道闭锁合并胆汁淤积症者；②同年龄段行臂丛神经损伤修复手术且肝功能正常者；③胆道发育不良及合并其他系统严重畸形(如先天性心脏病)者。

二、研究方法

记录患儿的基本临床资料(性别、年龄等)及肝功能、凝血功能检测结果并编号。收集实验组及对照组患儿全血样本，常温下以3 000 r/min的速度离心10 min，分离得到血清，通过ARCHITECT i2000测试仪及相应的ELISA试剂盒(雅培公司提供)测定血清PIVKA-Ⅱ含量。

以全血为样本测定凝血功能指标，测定仪器为全自动血凝仪，检测项目包括凝血酶原时间、国际标准化比值、活化部分凝血活酶时间及凝血酶原活度、纤维蛋白原等。

以血清为样本测定肝功能指标，测定仪器为日立制全自动生化分析仪，检测项目包括总胆红素、直接胆红素、谷丙转氨酶、谷草转移酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白等。

三、统计学方法

采用Graphpad Prism 6进行统计分析。采用Kolmogorov-Smirnov检验对所有连续型变量进行正态检验后发现所有计量资料均为非正态分布，故各组间PIVKA-Ⅱ水平采用中位数(四分位数)进行统计描述；两组间比较采用Mann-Whitney U检验；多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用Spearman法进行相关性分析，采用受试者工作曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)反映PIVKA-Ⅱ的诊断效能，不同AUC之间的比较采用Z检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结  果 一、PIVKA-Ⅱ在3组患儿中的分布

3组患儿PIVKA-Ⅱ水平分别为：胆道闭锁组29.39(19.29~173.80)mAU/mL；胆汁淤积组22.59(18.20~38.34)mAU/mL；肝功能正常儿童组24.77(21.01~29.20)mAU/mL(图 1)。Kruskal-Wallis检验结果显示3组患儿间PIVKA-Ⅱ水平存在统计学差异(H=15.63, P=0.0004)。两两比较的结果显示，胆道闭锁组与胆汁淤积组间有统计学差异(U=4086，P=0.0006)；胆道闭锁组与肝功能正常儿童组间有统计学差异(U=10600，P=0.0007)；而胆汁淤积组与肝功能正常儿童组间无统计学差异(U=8332，P=0.3898)。

二、不同性别患儿PIVKA-Ⅱ水平比较

131例患儿中，男56例(42.7%)，女75例(57.3%)。PIVKA-Ⅱ含量在不同性别患儿中比较无统计学差异(Mann-Whitney U检验结果显示U=16530，P=0.1815)。见图 2。

三、胆道闭锁手术日龄与PIVKA-Ⅱ水平的关联性分析

将131例胆道闭锁患儿按行手术时日龄分为3组，其中30~60 d组63例，60~90 d组53例，>90 d组15例。结果显示，30~60 d组PIVKA-Ⅱ水平为29.62(12.66~64.76) mAU/mL；60~90 d组为38.94(14.58~114.3)mAU/mL；>90 d组为22.13(13.94~28.17)mAU/mL。3组间PIVKA-Ⅱ水平比较无统计学差异(Kruskal-Wallis检验结果显示H=0.595, P=0.7423)。见图 3。

四、PIVKA-Ⅱ水平与术前肝功能指标的相关性

随着胆道闭锁患儿年龄的增加，碱性磷酸酶(H=5.804，P < 0.001)，谷氨酰转移酶(H=3.876，P=0.0447)，谷丙转氨酶(H=7.251，P=0.0002)呈逐渐升高的趋势，提示胆道闭锁患儿手术日龄越晚，肝功能损害程度越高(表 1)，但谷草转氨酶水平在各个年龄组间比较没有统计学差异(H=1.229，P=0.5409)。

由于胆道闭锁组PIVKA-Ⅱ水平升高较为明显，因此将患儿的血清PIVKA-Ⅱ水平与肝功能指标(总胆红素、直接胆红素、γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶、谷丙转移酶、谷草转移酶、白蛋白)分别进行相关性分析。结果显示PIVKA-Ⅱ与γ-谷氨酰转移酶、胆红素、肝功能、白蛋白之间无统计学相关性(P>0.05)。见表 2。

五、PIVKA-Ⅱ水平与术前凝血指标PT, INR, PTA, FIB的相关性

如表 3所示，Spearman相关性分析结果表明PIVKA-Ⅱ与PT(凝血酶原时间)、INR(国际标准化比值)、PTA(凝血酶原活度)、FIB(纤维蛋白原)之间均无统计学相关性。

六、PIVKA-Ⅱ诊断效能分析

使用受试者工作曲线(ROC)评估PIVKA-Ⅱ用于胆道闭锁和胆汁淤积鉴别诊断的价值，求得曲线下面积(AUC)=0.6373。ROC曲线下所有计算“灵敏度-(1-特异度)”，得到的结果按降序排列后即获得约登指数最大值及其对应的灵敏度与特异度，本研究结果中约登指数为0.3278。通过约登指数找出最佳临界值为74.03 mAUmL，其对应的灵敏度与特异度分别为97.67%和35.11%，阳性似然比为1.5000，阴性似然比为0.0600。提示PIVKA-Ⅱ单独诊断胆道闭锁敏感性较高，但特异性欠佳。见图 4。

讨  论

胆道闭锁进展过程中，如不能早期行Kasai手术，患儿常因肝功能衰竭在1~2岁时死亡。目前我国大陆地区胆道闭锁的诊断和治疗流程仍不够规范，按照2013年中华医学会新生儿外科学组和小儿肝胆外科学组共同制定的《中国大陆地区胆道闭锁诊断及治疗(专家共识)》，胆道闭锁目前常见的辅助诊断途径包括大便比色卡、B超、同位素检查等^[1]。而根据国内现状及我国专家共识，若患儿胆囊穿刺为白色胆汁，且经术中胆道造影提示肝内胆管无显影即可确诊为胆道闭锁。而结合实验室指标变化(如直接胆红素升高超过总胆红素50%和显著的γ-谷氨酰转肽酶升高等)并不能显著提高诊断的特异性及敏感性^{[11, 15-16]}。

PIVKA-Ⅱ是一种异常凝血酶原，有文献曾报道可在肝胆疾病患儿血清中检测到高水平的PIVKA-Ⅱ^[12]。目前将其作为一种新型肿瘤标记物广泛应用于肝细胞肝癌患儿的早期诊断、预后评估、复发监控等^[9-12]。本研究中，PIVKA-Ⅱ水平在胆道闭锁与胆汁淤积组间及胆道闭锁与正常儿童组间均有统计学差异，提示PIVKA-Ⅱ在胆道闭锁的术前诊断中具有一定价值，或可作为一种术前诊断的标志物。按照本研究得到的最佳临界值，即认为PIVKA-Ⅱ>74.03 mAU/mL时诊断胆道闭锁意义更大。而此时PIVKA-Ⅱ敏感性与特异性分别为97.67%和35.11%，与文献报道GGT(γ-谷氨酰转移酶)的鉴别诊断效能相比偏低^[13-16]。有文献指出，PIVKA-Ⅱ生成的机制主要包括肝细胞内凝血酶原形成过程中的关键酶(γ-谷氨酸羧化酶)活性降低、机体局部维生素K不足及低氧刺激导致细胞骨架及表型的轻微改变影响到Vk摄取等^[10]。因此我们有理由认为，胆道闭锁患儿可能因肝功能受损造成生物酶活性降低及合成障碍、机体摄取维生素K能力下降等，致使机体凝血酶原合成障碍，从而产生PIVKA-Ⅱ。胆道闭锁患儿谷丙转氨酶、碱性磷酸酶及γ-谷氨酰转移酶在3组不同年龄段患儿中的水平存在一定差异，即胆道闭锁Kasai手术前患儿年龄越大，肝功能损害可能越严重，与既往文献报道结果一致^[13]。但PIVKA-Ⅱ水平在各手术日龄组之间比较并无统计学差异，因此有理由认为PIVKA-Ⅱ水平与肝功能损害程度不相关。此外，PIVKA-Ⅱ与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶及白蛋白之间亦没有统计学相关性，PIVKA-Ⅱ与胆道闭锁患儿的病情进展不相关，说明胆道闭锁患儿血清PIVKA-Ⅱ升高可能并非肝功能受损所致。

胆道闭锁患儿往往存在凝血功能异常，表现为凝血酶原时间(PT)延长，凝血酶原活度(PTA)下降，国际标准化比值(INR)指标超出正常值，同时伴随一定程度的纤溶激活^{[11, 14, 15]}。据文献报道PIVKA-Ⅱ和INR呈线性相关，和PT、APTT等其他凝血指标则不相关^[4]。而本研究中PIVKA-Ⅱ与凝血指标并没有统计学相关性，这提示胆道闭锁患儿PIVKA-Ⅱ水平的影响因素可能较多，机体凝血功能异常只是其中之一。另外，本中心胆道闭锁患儿来自全国各地，在调查病史过程中，家属对既往治疗史、外院病史等信息表达不够清楚，导致研究者在因素分析环节时无法完全排除回忆偏倚造成的信息失真，这可能也是影响本研究结论的潜在因素。