2022, Vol. 21
儿童脑肿瘤已经超过儿童白血病，成为发病率和病死率均居首位的儿童肿瘤[1]。髓母细胞瘤(medulloblastoma, MB)是最常见的儿童恶性脑肿瘤，被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)定为Ⅳ级肿瘤[2]。目前临床根据患儿年龄，肿瘤有无播散、切除程度以及病理亚型进行危险分层[3]。近年又根据基因分型将MB分为四个亚型(WNT、SHH、Group 3和Group 4)，各亚型生物学特征和预后各不相同[4]。Ramaswamy等[5]在分子亚型的基础上提出了最新的危险分层。有研究表明，细胞增殖指数与无进展生存率、整体生存率密切相关[6]。Ki-67蛋白一直被广泛用作人类肿瘤细胞增殖的标志物，其存在于细胞周期所有活跃阶段(G1期，S期，G2期和有丝分裂期)，但在静止期(G0期)细胞中不存在[7]。在乳腺癌、膀胱癌患者中，Ki-67已被证明是评价预后的重要指标[8-9]。国内多项研究发现，Ki-67的表达量是成人MB预后的独立影响因素[10-11]。而在儿童(＜18岁)MB中，Ki-67与患儿预后的关系还未见报道。本研究中我们收集MB患儿临床病理资料，旨在评估Ki-67指数与MB患儿预后之间的关联性。
材料与方法 一、临床资料以2006年1月至2015年12月上海交通大学医学院附属新华医院收治的103例MB患儿为研究对象，收集患儿年龄、性别、组织病理分型、Ki-67指数(术后病理报告中的Ki-67表达量)、影像学特征(肿瘤位置、大小、有无转移)、手术切除程度(根据手术记录和术后72 h内MRI结果)分为全切或近全切(术后磁共振显示：肿瘤无残留或残留＜1.5 cm2)，次全切除(术后磁共振显示肿瘤残余超过1.5 cm2)两类、生存时间(从手术到死亡或随访截止时间)、术后转移或复发时间(从手术到发现转移灶或复发灶的时间)、放疗和化疗情况等[12]。本研究经上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会审核批准(XHEC-D-2022-144)。
二、入组标准纳入标准：①经术前影像学检查及术后病理结果确诊为MB并行Ki-67检测；②存在原发肿瘤；③年龄≤18岁。排除标准：①围术期死亡；②随访期间非肿瘤原因导致死亡；③随访时间少于5年。
三、组织分子病理组织学分型：按照2016版WHO中枢神经系统肿瘤分类标准，分为经典型MB (classic medulloblastoma, CMB)、结缔组织增生或结节型(desmoplastic/nodular medulloblastoma, DMB)、广泛结节型(medulloblastoma with extensive nodularity, MBEN)、大细胞/间变型(large cell and anaplastic medulloblastoma, LC/A)以及NOS未分类肿瘤[12-14]。
四、Ki-67染色及计数由本院病理科进行Ki-67的免疫组织化学检测。细胞核有黄色沉着为Ki-67阳性细胞。选取5个不同高倍镜视野, 分别计数500个细胞, 计算Ki-67阳性细胞数占总细胞数的百分比。
五、随访内容术后每3个月随访1次头部增强MRI、每6个月随访1次头部和全脊椎增强MRI；或出现新发症状(头痛、呕吐、腰痛、四肢无力等)的情况下及时行头颅和全脊椎增强MRI，观察有无肿瘤复发和转移。通过电话、门诊等方式对患儿进行随访。按照预后情况分为存活组和死亡组、进展组和非进展组。
随访开始日期为2006年1月1日，截止日期为2020年12月31日，并计算预后相关指标，包括：①总体生存时间(overall survival，OS)：从手术到死亡或截至随访的时间；②总体无进展生存时间(progression free survival，PFS)：从手术到疾病出现进展(包括转移、复发、死亡)或截至随访的时间。
六、统计学处理使用SPSS 21进行统计学分析(图 1)。分类变量以相对数、构成比或率(%)表示；对符合正态分布的连续变量采用独立样本t检验；使用Kaplan-Meier方法构建生存曲线，使用Log-rank检验(单因素分析)分析各亚组之间OS和PFS的差异。单变量分析中有统计学意义的因素被放入Cox比例风险回归模型中。P＜0.05为差异有统计学意义。
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图 1 儿童髓母细胞瘤病例纳入流程图 Fig.1 Flow chart of included cases |
根据入组标准，103例患儿中67例最终纳入分析(图 1)，67例MB患儿年龄(5.24±2.94)岁，年龄最小1.03岁，最大11.56岁；＜5岁31例(31/67，46.27%)，≥5岁36例(36/67，53.73%)；男49例(49/67，73.13%)，女18例(18/67，26.87%)。主要临床症状包括头痛、呕吐、共济失调、眼球震颤、颅神经麻痹、头围增大等。依据Chang氏分期标准，M(0)期56例(56/67，83.58%)，M(+)期11例(11/67，16.42%)。MB位于小脑蚓部22例(22/67，32.84%)，四脑室42例(42/67，62.69%)，小脑半球3例(3/67，4.48%)。经典型45例(45/67，67.16%)，促纤维增生/结节型7例(7/67，10.45%)，伴广泛结节型5例(5/67，7.46%)，大细胞/间变型1例(1/67，1.49%)，未分类9例(9/67，13.43%)。
67例患儿中54例有新鲜冷冻肿瘤组织标本，对该54例标本进行RNA-seq测序，37例质检合格(37/54，68.52%)，根据RNA-seq检查结果，其中WNT 1例(1/37，2.7%)，SHH 8例(8/37，21.62%)，Group3 10例(10/37，27.03%)，Group4 12例(12/37，32.43%)，Group3-Group4 6例(6/37，16.22%)；未分类30例(30/67，44.78%)。
肿瘤全切63例(63/67，94.03%)，大部切除4例(4/67，5.97%)；术前有脑积水症状经手术干预37例(37/67，55.22%)，保守治疗30例(30/67，44.78%)；术后行化疗53例(53/67，79.10%)，未行化疗14例(14/67，20.90%)；放疗55例(55/67，82.09%)，未放疗12例(12/67，17.91%)。见表 1。
| 表 1 67例MB患儿5年总体生存时间和总体无进展生存时间影响因素的单因素分析 Table 1 Univariate analysis of prognostic factors for OS/EFS in 67 MB children |
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Ki-67阳性指数为(34.85±16.72)%，范围5.00%~90.00%。按患儿预后及肿瘤进展分组统计，存活组为(30.53±13.24)%，死亡组为(40.52±19.20)%；进展组为(31.50±12.94)%，未进展组为(37.57±18.99)%；存活组和死亡组Ki-67表达量差异有统计学意义(P=0.01)，进展组与未进展组Ki-67表达量差异无统计学意义(P=0.14)。根据ROC曲线计算Ki-67的最佳临界值为35%，以此为界，将Ki-67分为两组：Ki-67＜35%为低表达组，30例(30/67，44.78%)；Ki-67≥35%为高表达组，37例(37/67，55.22%)。
三、MB预后情况及相关因素67例患儿术后5年随访中，30例无进展生存(PFS: 44.78%)，38例存活(OS: 56.72%)，患儿随访时间为(60±35.06)个月，复发转移时间为术后(11.93±12.44)个月。单因素生存分析结果显示：组织病理分型、术后放疗和化疗与术后转移、复发有关(P＜0.05)，见图 2；Ki-67表达量、术后放疗和化疗与总体生存时间有关(P＜0.05)，见图 3。多因素生存分析显示：放疗是术后转移、复发的独立影响因素(P＜0.05)；Ki-67表达量和术后放疗是患儿整体生存时间的独立影响因素(P＜0.05)，见表 2。
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图 2 MB患儿PFS生存曲线图 Fig.2 Univariate analysis of PFS survival curves A: 组织病理与PFS的关系(P=0.03)；B: 放疗与PFS的关系(P＜0.01)；C: 化疗与PFS的关系(P＜0.01) 注 MB：髓母细胞瘤; PFS: 无进展生存时间 |
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图 3 MB患儿OS生存曲线 Fig.3 Univariate analysis of OS (overall survival time) survival curve A: Ki-67与OS的关系(P=0.02)；B: 放疗与OS的关系(P＜0.01)；C: 化疗与OS的关系(P＜0.01) 注 MB：髓母细胞瘤; OS: 总体生存时间 |
| 表 2 MB患儿OS影响因素的多因素分析 Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors for OS in MB children |
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MB是一种复杂的异质性疾病，具有不同的组织学类型和不同的生物学临床特征。近几年来，分子分型在MB患儿的个性化精准治疗中扮演着极其重要的角色。然而由于分子病理检测费用高、周期长，目前仍处临床试验阶段。
目前根据患儿年龄、术前有无转移、手术切除范围、组织病理分类将髓母细胞瘤患儿分为标危组和高危组[3]。2015年新疆医科大学通过对85例髓母细胞瘤进行研究，发现间变型髓母细胞瘤Ki-67的表达比其他类型髓母细胞瘤高，说明Ki-67表达与髓母细胞瘤组织病理分类有关[23]。Ki-67指数作为重要的增殖标志物之一，与多种肿瘤的预后有关[8-9]。而在儿童MB中，Ki-67指数的预后意义存在争议。有研究者认为，Ki-67指数高与MB患儿预后不良相关，而其他研究则否认Ki-67指数会影响MB患者预后，这种分歧可能与选择Ki-67表达量的临界值不同有关[15-18]。Ki-67是由MKI67基因编码的核蛋白，在细胞周期、细胞增殖和核糖体RNA转录中起关键作用[19]。细胞在进行有丝分裂时，Ki-67负责维持染色体分散于细胞质中，它主要覆盖在有丝分裂时期染色体的表面，主要与超螺旋DNA和AT-富集区DNA结合[20]。Ki-67通常在细胞分裂的G1晚期、S期、G2期和M期表达，在G0期不能检测到Ki-67蛋白，而在G2期，Ki-67蛋白在有丝分裂过程中高表达[21]。除此之外，Ki-67还常用作疗效的药理动力学标志，尤其是在接受化疗的乳腺癌患者中[22]。
本研究中，Ki-67阳性表达高于35%为高Ki-67指数组，低于35%为低Ki-67组，高Ki-67指数组患儿(5年OS：51.35%，5年PFS：36.67%)比低Ki-67组患儿(5年OS：70.27%，5年PFS：40.00%)预后更差，但PFS差异没有统计学意义，与Zhao等[10]在成人MB(18~45岁)患者中的研究结果相似。因此，我们将Ki-67指数作为评估儿童MB预后的生物标志物。
本研究存在一定的局限性。首先，本研究为单中心回顾性研究，样本量少，难以消除偏倚因素；其次，本研究中未分析各分子亚型的预后，今后我们将扩大样本量，进一步结合分子病理和Ki-67指数，验证Ki-67表达量与儿童MB预后的关系。
本研究中67例髓母细胞瘤患儿5年PFS为44.78%，OS为56.72%，与华山医院治疗结果相似，而国外研究报道远高于国内的5年生存率，这也说明我国髓母细胞瘤的诊治尚处于相对落后状态[5, 24]。因此，2017年5月，本研究中心牵头成立了中国儿童脑肿瘤协助组，开展国内多中心髓母细胞瘤临床回顾性研究，这将有助于规范儿童、青少年脑肿瘤的综合治疗，促进其基础研究和临床研究的发展。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 文献检索为梁壮壮、曹亮亮，论文调查设计为王佳甲、马杰, 数据收集与分析梁壮壮、赵恒, 论文结果撰写为梁壮壮、赵阳、王保成, 论文讨论分析为梁壮壮、马杰
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