基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(编号:81401190)
通信作者:许韩峰:Email:200327419xhf@163.com; 李清:Email:liq73@163.com
1.南华大学附属第一医院泌尿外科科室(湖南省衡阳市,421001); 2.重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科科室(重庆市,400014)
1.Department of Urology Surgery,First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421001,China.2.Department of Urology Surgery,Children's hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,400014,China.
Hypospadias; Diethylhexyl Phthalate; Smad7 Protein; Smad3 Protein; Smad2 Protein; Rats
DOI: 10.3969/j.issn.1671 — 6353.2018.02.012
尿道下裂是儿童常见的先天性泌尿生殖器畸形,发生率约为16.9/10 000,且报道有明显上升趋势[1]。畸形主要是由于尿道和包皮的环形闭合障碍而导致尿道开口异位,可异位于阴茎腹侧任何位置,甚至阴囊和会阴区。但其病因尚不明确。
邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,(DEHP)] 是一种塑化剂,也属于白色污染源,是一种重要的人工合成的环境内分泌干扰物,具有环境内分泌干扰作用,国内外相关研究以及我们以往研究已成功利用DEHP诱导建立先天性尿道下裂大鼠模型[2-4]。这是一个成熟的可以直接利用的动物模型。
Ross等[5]通过对尿道下裂大鼠全基因组芯片分析,发现差异性表达最丰富的区域主要包含β型转化生长因子(TGF-β)信号级联系统。国内外有大量报道证实TGF-β1表达上调与尿道发育和尿道下裂发生密切相关[3,4]。Smad蛋白,作为TGF-β信号系统的细胞内效应器,能将细胞膜信号带入细胞核内。一般Smads蛋白家族根据结构和功能的不同可以分为3级: ①通路限制性Smads(Smad1,2,3,5,8); ②普通Smads(Smad4或Smad4β); ③TGF-β信号抑制性Smads(Smad6,7)。不同的Smads家族成员在信号通路中扮演不同的角色。
之前研究人尿道下裂包皮组织时,发现Smads蛋白中的Smad7,Smad3和Smad2在尿道下裂患者包皮组织中表达上调[6]。限于伦理学局限,本研究拟在前期DEHP成功诱导的尿道下裂动物模型[2],在大鼠尿道下裂阴茎组织中观察Smads(7,3和2)的表达是否仍存在差异,以进一步验证并探索Smad7,Smad3和Smad2与尿道下裂发生的相关性及尿道下裂的可能发病机制。
1. 实验动物:SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠,约10周龄,雌性40只,体重(260±10)g,雄性10只,体重(320±10)g,购买及饲养于南华大学实验动物中心(许可证号:SYXK(湘)2015-0001)。SPF级别饲养间。孕期计算以雌、雄大鼠按1:1比例合笼后,每天上午固定时间检查笼底有无精液栓,发现精液栓的当天确定为孕0天(Gestation day,GD0)。分4批合笼,准确记录并标记每只雌鼠受孕成功的时间。本研究遵从国际实验动物护理和使用指南。
2. 试剂:DEHP(分析纯,浓度>99%,上海化学试剂有限公司生产); 市售精制大豆油(金龙鱼,上海生产); 兔(小鼠)二步法检测试剂盒(含3%H2O2液)和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),封闭用正常山羊血清工作液(北京康为世纪生物科技有限公司),小鼠来源Smad7单克隆抗体(sc-101152,Santa Cruz Biotechnology)和兔来源Phospho-Smad2/3单克隆抗体(#8828,Cell Signaling Technology),0.01M枸橼酸盐缓冲液参照CST公司抗体说明书配制,Prime script RT 试剂盒(大连Takara生物科技有限公司),高纯总RNA快速提取试剂盒和2×SYBR Real-time PCR Premixture(北京百泰克生物科技有限公司)。
1. 动物分组、给药: GD12的40只健康孕鼠随机分为2组,每组20只。包括DEHP 750 mg·kg-1·d-1剂量组(根据之前报道得出的最适诱导浓度[2],DEHP暴露组)、大豆油对照组(正常对照组)。对照组以1.5 mL大豆油灌胃,实验组将相应剂量药物溶于1.5 mL大豆油中,自GD12至GD19连续每天定时给药1次。
2. 组织标本的制备:孕鼠在怀孕第20天行剖宫产取出胎鼠,以有无睾丸或子宫判断胎鼠性别,从每窝雄性胎鼠的阴茎组织中取一个用4%多聚甲醛溶液固定48 h; 其余的立即置于液氮中冻存备用。
3. RNA提取和实时定量聚合酶链反应(qPC-R):候选基因特异性引物和最适退火温度见表1; 具体实验操作步骤参照说明书和以往报道[7]。
4. 免疫组化检测:一抗稀释度:Smad7,1:100稀释,p-Smad2/3,1:1 000稀释; 具体实验操作步骤参照说明书和以往报道[7]。
本研究利用SPSS 21.0软件进行统计学分析,实验中计量资料以均数±标准差(x^-±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
经qPCR检测分析后发现,Samd7、Smad3和Smad2三者mRNA在正常对照组相对于内参GAPDH的表达分别是1.00,0.84和1.14,在DEHP暴露组其相对表达分别是1.87,1.36和1.49,且三者在实验组的表达与正常对照组比较,均升高(P值分别是<0.001,0.041和0.021,见图1)。荧光扩增曲线见图2。
图1 qPCR分析DEHP暴露后胎鼠阴茎组织中Smads mRNA相对于正常的表达
Fig.1 The expression of Smads mRNA in DEHP exposed rat penis and normal control(qPCR)
胎鼠阴茎横切面免疫组织化学结果显示,Smad7和p-Smad2/3蛋白主要分布于阴茎包皮皮下和尿道周围海绵体,二者在DEHP暴露组胎鼠阴茎组织中的表达较正常对照组有显著增强趋势; 分布更广,且更多地分布于皮下疏松结缔组织层(棕黄色提示阳性表达,见图3)。
Smad7和p-Samd2/3在DEHP暴露后胎鼠阴茎组织中的表达更强,分布更广,且多分布于阴茎皮下疏松结缔组织层中。
本研究中,我们在之前研究的基础上利用DEHP诱导的先天性尿道下裂大鼠模型[2,7],发现DEHP暴露后,胎鼠阴茎组织中Smad7,Smad3和Smad2基因mRNA表达水平较对照组显著升高,且Smad7和磷酸化Smad2/3蛋白的表达水平亦有明显增强。因此我们提出假说Smad7,Smad3和Smad2表达上调参与尿道发育并与尿道下裂的发生有关。目前许多关于Smads蛋白功能的研究多集中在发育和肿瘤发生过程中TGF-β信号通路的调控。然而就我们所知,还没有关于Smad7和磷酸化Smad2/3过表达与尿道发育和尿道下裂发生相关的研究。因此,有必要通过对已知Smads蛋白功能的推测来解释和提供Smads过表达与尿道下裂之间关系。
雄性外生殖器的发育过程及调控非常复杂,包括基因编程、细胞分化、激素信号、酶活性和组织重塑; 这些都必须以时间和浓度依赖的方式有条不紊地进行才能保证形成正常的阴茎[8]。鼠尿道的形成与人类尿道的发育类似,并具有相关性。Baskin等[9] 在研究老鼠阴茎尿道的形成和发育过程发现,尿道的形成存在尿道襞在中线处接触融合形成上皮缝以及随后的尿道上皮细胞层消失,被正常管状尿道取代的过程; 该过程是通过间充质细胞迁移到达腹侧尿道中部去取代残余的上皮细胞实现的。任何对细胞迁移或尿道缝形成和重塑产生影响的因素均可能导致尿道下裂。
Ross等[5]报道尿道下裂的发生不仅与TGF-β信号系统有关,而且与MAPK信号系统系统也密切相关,JNK作为MAPK成员中非常重要的一员,有报道证实JNK在各种细胞迁移中扮演重要角色[10,11]。我们以往研究不仅从尿道下裂患者包皮组织还从尿道下裂大鼠阴茎组织证实JNK的表达上调与尿道下裂的发生相关[7,12]。Maire等[13]研究发现Smad7过表达能诱导JNK激酶活化; 因此,我们认为Smad7过表达影响细胞迁移,从而阻碍尿道发育,可能是通过上调JNK激酶的表达而导致尿道下裂产生的一个重要的信号转导蛋白。
雄性生殖系统形成必然经历外生殖器男性化的过程,这种男性化的突出特征就是尿道的性别分化和性器官的大小,也就是说阴茎的大小发育和正常形态,雄激素是维持这一过程正常进行的一个关键诱导剂[14]。有学者[15]证实雌激素受体(ER)抑制TGF-β诱导的Smad3活性的激活,同时,TGF-β信号通路能反馈性增强ER介导的转录活性。有报道雄激素受体(AR)与Smad3有直接相关[16]; 其配体结合区直接抑制Smad3与Smad-结合元件的结合,进而可抑制TGF-β转录应答。也就是说,AR和ER均能抑制Smad3的活性,但同时AR通过抑制TGF-β表达,有减弱TGF-β对ER的反馈性激活作用; 因而在尿道下裂患者Smad3表达上调。Li CG等[17]研究发现小鼠Smad3基因敲除后TGF-β1 表达水平明显下降,这刚好解释了为什么Smad3基因上调,TGF-β1上调时尿道下裂发生这一系列的合理性。同时,Chong Q等[18]研究大鼠模型时也证实TGF-β/Smad3通路在尿道下裂发生中扮演重要角色。
Smad2与Smad3有92%的序列同源性,两者同属于1型受体激酶的底物,被激活素和TGF-β受体所活化,具有通路特异性。Smad2作为TGF-β的一个下游转录因子,对牙龈创面愈合过程中的上皮再生具有抑制效应[19]。Shimoe等[20]研究发现Samd2的过表达促进p15和p21表达,阻碍进入细胞周期,在牙龈上皮细胞产生抗增殖作用。同时有报道[21]证实作为TGF-β信号通路的转导中介,Smad2在创面愈合调控角质化细胞的迁移和上皮再生过程中起决定性作用。本研究中DEHP暴露后阴茎组织中Smad2在mRNA和蛋白磷酸化水平表达上调。其导致尿道发育障碍或尿道下裂发生是否通过对尿道上皮细胞的增殖、迁移和上皮化的抑制效应而实现,还有待深入研究。
综上所述,我们推测DEHP暴露后诱导尿道下裂的产生可能是由于Smads(7,3和2)表达上调,通过TGF-β1过度表达,反馈性增强ER介导的转录活性,导致的Smad3上调,以及通过激活JNK激酶抑制尿道上皮细胞增殖、迁移和上皮化等途径,从而影响尿道的正常环形闭合。但是这样一个推测的TGF-β/Smad信号通路,其中Smad7,Smad3和Smad2三者之间确切的信号传递和上下游调控机制尚不明确。因此,有必要进一步进行体外阴茎的组织培养实验及信号传递和干预方面的研究,以便更好的解释Smads在尿道下裂发病机制中的作用。