先天性巨结肠(hirschsprung's disease,HSCR)是一种常见的胃肠动力障碍性疾病,由肠神经节细胞缺乏所致。其发病率约为1/4 000～1/5 000,男女发病率比约为41:1 ^[1]。按神经节细胞缺乏所累及肠管的长度不同,国际上常将HSCR分为三型:短段型(short-segment HSCR,SHSCR)、长段型(long-segment HSCR,LHSCR)和全结肠型(total colon aganglionosis,TCA )^[2]。此外,还有几乎罕见累及全部肠管类型的全肠型巨结肠(total intestine aganglionosis,TIA)。HSCR患者临床上常表现为功能性的结肠梗阻、便秘和小肠结肠炎等; 累及肠管长度越长,病情越严重,如不及时进行治疗,最终会导致死亡^[1-3]。目前HSCR以手术切除病变肠段为主,尚无其他有效的治疗手段。手术治疗虽能挽救患儿的生命,国内外研究人员发现,HSCR术后存在明显的并发症,以便秘、大便失禁、反复小肠结肠炎和营养障碍等多见,部分甚至需要行永久性回肠造瘘术^[1-3]。因此,亟需进一步的深入研究HSCR的发生机制,并研究新的治疗策略,以期改善疾病的预后,提高患儿的生活质量。

先天性巨结肠的基本病理改变为:病变肠壁缺乏神经节细胞; 病变肠管的自主神经系统分布紊乱、神经递质含量异常。目前普遍认为HSCR主要发病机制与胚胎时期肠神经嵴细胞(enteric neural crest cells,ENCCs)迁移、发育、存活异常有关^[4]。ENCCs在肠道内发育形成肠神经系统是一个十分复杂的过程,受其自身与周围环境中各种调控因子的影响和精确调节^[5]。其中,胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其配体酪氨酸蛋白激酶受体(RET)信号途径的研究较为广泛^[3]。ENCCs表面表达RET,而肠道间质细胞表达GDNF,趋化引导ENCCs在肠道内的迁移,不同部位GDNF的浓度差是影响ENCCs迁徙的重要因素^[6]。临床综合征病例中也证实,GDNF所在染色体区域的整体缺失与HSCR有关^[4]。在动物模型中的研究表明,RET信号是ENCCs在肠道内迁移、存活、增殖和分化所必需的^[3]。

目前广泛认为遗传因素在先天性巨结肠的发生发展中起着关键的作用^[7-12]。近年来,得益于高通量分型、测序技术的飞速发展,国内外研究人员发现了一系列与先天性巨结肠发病和临床亚型相关的遗传变异^[8,9]。国内外研究证实,RET基因是胚胎时期决定肠神经系统命运的至关重要的基因。据文献报道,在50%的家族性HSCR患者及7%～35%散发性HSCR患者中可见RET编码区的基因突变^[13,14]。多数突变可导致RET蛋白剂量不足或RET蛋白的功能丧失^[15]。RET基因的异常表达可能导致ENCCs的异常定植,甚至可能促进ENCCs的凋亡,从而导致HSCR的发生。GDNF家族作为RET蛋白的受体在肠神经系统发育过程中对ENCCs的存活起着重要作用^[16]。虽然目前为止发现的GDNF基因突变尚未足以引起HSCR发生,但是否GDNF基因突变与其他基因共同作用从而导致HSCR的发生犹未可知^[17-23]。ednrb/edn3基因及其信号通路在HSCR的发病中也被广泛研究。Lee HO等^[24]研究表明,ednrb蛋白及其配体edn3在小鼠的肠神经嵴细胞系及人黑色素瘤细胞系的发育及分化过程中起至关重要的作用。阻断ednrb的小鼠模型表现出常染色体隐性遗传的白斑性变及先天性巨结肠表型。可见ednrb/edn3基因及其信号通路在神经嵴细胞的分化发育中扮演重要角色。但至今为止,在家族性HSCR及散发型HSCR患者中发现的包括大片段的基因缺失在内的超过20个ednrb基因突变,仅占所有巨结肠患者中的5%^[25]。end3基因研究结果与ednrb基因相似。研究表明,ednrb/edn3基因突变往往发生在肠神经细胞向后肠的迁移过程中^[26]。因此ednrb/edn3基因突变主要导致SHSCR发病风险。而RET基因突变可以发生在肠神经系统发育的任何时期,所以常见于LHSCR患者中。据估计,HSCR患者中发现RET基因突变者占50%,而ednrb突变约占5%,并且SHSCR中RET基因突变占25%,而SHSCR中95%的病例与ednrb突变相关。

此外,亦有学者对合并某些遗传综合征的家族性或散发型HSCR患者进行致病基因的挖掘。Lee KE等^[27]研究表明,sox10基因编码对神经嵴细胞的迁移、分化起重要作用的转录因子。sox10基因对胚胎期肠内神经细胞的功能状态的维持起重要作用。除了avencia等报道了一例孤立性HSCR患者出现sox10基因突变以外,其他研究者报道的sox10基因突变均合并某遗传综合征。因此,sox10基因并非HSCR的主要致病基因。另外,zfhx1b基因也作为合并其他遗传综合征的HSCR相关致病基因被报道,而孤立型HSCR中zfhx1b基因突变未见。Garcia-Barceló M 等^[28]研究表明,phox2b基因突变可能通过影响RET蛋白表达从而导致HSCR发生。Nakakimura S等^[29]报道,l1cam作为X染色体连锁的脑积水相关基因,研究发现一例l1cam基因突变患者合并HSCR。但孤立性HSCR患者中l1cam基因突变未见报道。也有不同的学者在合并不同遗传综合征的HSCR患者中发现不同的基因突变,如kiaa1279基因、TGF4基因等,但并没有相关基因的孤立性HSCR病例报道^[2]。

虽然RET信号通路被广泛认为与先天性巨结肠发病最为密切的通路,然而由于先天性巨结肠发病率较低,已知致病突变多来源于独立家系报道,针对该通路中的致病遗传突变尚未有系统性的群体研究,缺乏系统性的筛查总结指导临床诊断与治疗。随着高通量基因分型技术的广泛应用,全基因组关联分析(GWAS)被逐渐运用在包括先天性巨结肠在内的各种复杂疾病易感基因的发掘。2008年Garcia-Barcelo MM等^[8]首次证实NRG1为先天性巨结肠的易感基因; 2012年Tang CS等^[12]发现NRG3中11个新发结构突变被证实与先天性巨结肠相关。证实在先天性巨结肠散发病例存在较家系中发现的罕见突变而言外显率较低的易感基因。2014年,Kim JH等^[9]又提出了SLC6A20、RPRA、ABCC9等多个潜在易感基因。2016年,相同的研究团队基于SLC6A20的潜在易感位点进行精细定位提出SLC6A20多个潜在易感位点^[30]。2016年Tang CS等^[31.32]利用跨人群大样本在证实前期已知的RET、NRG1等以外,又提出了SEMA3为全新的易感基因。然而,先天性巨结肠的病因比较复杂,虽然分子遗传学取得了如上述巨大进展,但仍不能完全解释先天性巨结肠的起因,提示尚有多种未发现的遗传因素。特别是基于不同人群中的群体遗传易感机制的筛查,寥寥无几,故而有待后续挖掘。GWAS方法鉴定出的复杂疾病易感基因上的遗传变异大多位于非编码区,且多为常见变异,故而尚未直接明确其与基因表达/功能、疾病发生三者之间的联系。Ng SB等^[33]在2010年首次运用全外显子测序技术发现了米勒综合征(Miller Syndrome)的致病基因DHODH,该研究不仅首次证明新一代测序在单基因疾病中运用的可靠性和巨大潜能,更为后来的相关研究开启了新的一扇大门^[26]。So MT等^[34]利用目标区域测序技术,在601个散发先天性巨结肠病人中筛查了RET基因的22个外显子区域,发掘出编码区多个稀有突变,解释了RET基因针对先天性巨结肠疾病本身的人群异质性。此外,Luzóntoro B等^[35]在2015年利用外显子测序的方法检测了8个复发家系,同样证明了家族性先天性巨结肠具有很高的遗传异质性。然而迄今为止,这些已知与先天性巨结肠发生、发展密切相关的常见变异、罕见变异并未见系统性遗传准则直接指导临床预防、诊断乃至治疗。

进一步探索HSCR未知的遗传机制至关重要。本团队前期已针对大宗华南地区HSCR患儿展开系列遗传筛查,验证了高加索人群的一系列遗传变异,同时提出了多个全新的遗传相关基因。例如提出新的易感基因AUTS2,其表现为与NRG1相关位点之间产生遗传相互作用从而增加先天性巨结肠患病风险。并针对全新的遗传相关基因利用已建立的神经样细胞模型平台,斑马鱼模型平台进一步进行功能验证,已确认新证基因影响疾病本身的具体机制。完善疾病热点谱,合并新挖掘到的针对华南人群特异遗传变异,有效建立自己的遗传诊断文库,进而制备先天性巨结肠遗传诊断芯片,为临床诊断提供更为有效的证据,并为先天性巨结肠病人的个性化医疗提供帮助,为患儿及患者家属提供迅速的诊断指标以及临床建议^[36]。

诚然,基于HSCR本中心开展了一系列遗传机制的临床转化研究。其预防、诊断和治疗依然面临诸多挑战。众所周知,疾病的发生是一个动态的过程,在此期间发生的许多独立事件都可能是致病的协同作用。单纯针对某一时间点的临床样本进行后续研究可能会有失偏颇。而队列研究可观察多个因素的多种临床效应,而这正是队列法不可取代的用途,为疾病个体的精准化医疗提供了更为详实的病程记录。本中心拟在前瞻性出生队列公共平台的基础上建立HSCR疾病队列,队列中健康人群组已逐步生成多组学数据,包括基因组、转录组、蛋白组、代谢组和肠道菌群的宏基因组数据,可以综合、立体、量化反映个体健康状态,也可以成为疾病研究无可替代的黄金对照^[37]。这给HSCR的发生发展提供了重要的溯源研究资源,也为系统地、多时点地描述疾病的发展提供了可能,同时通过将生物样本库中的组学信息与流行病学数据、电子病历系统进行整合匹配,为HSCR提供更细致疾病分类,更深入的阐释发病原因和更准确的预测疾病风险或治疗效果。

近年来迅速发展起来的基因诊断技术,在出生缺陷与遗传病检测领域获得广泛应用。以听力损失(障碍)为例,约2/3是遗传因素所致。目前已经发现160多个与遗传性听力损失相关的位点,我国已经建立了筛查遗传性听力损失的基因芯片技术,在北京等地开展了大量人群的筛查。然而,针对遗传性较为明显的HSCR尚未有行之有效的早期预测方案。精准医疗能有效突破传统检测技术的效率瓶颈,但通常需要获得大量的序列变异数据,鉴别变异是否为致病突变,不仅需要大量数据库的信息比对,更需要结合患者的临床表型、家系分析,才能获得正确的诊断结果,对数据的准确分析、解读数据与疾病的关系,仍是目前高通量测序应用中的难点^[38]。如何将临床表型与组学大数据进行管理,实现患者精准诊断、治疗和预防,仍然是我们面临的困难。未来研究需要根据队列人群研究,通过流行病学设计和统计学方法建立起涵盖家族史、症状、体征、实验室检查结果、遗传检测结果和分子标志物检测结果等多位变量的诊断或预测模型,从而实现出生缺陷疾病风险的预测、对疾病的精准诊断和分类、对治疗方案的精准应用以及对疗效的精准评估和对预后的精准预测。